[发明专利]拟南芥糖基转移酶UGT74D1在催化合成生长素糖酯中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种糖基转移酶的应用，尤其涉及一种拟南芥糖基转移酶UGT74D1在催化合成生长素糖酯中的应用；属于生物技术领域。

背景技术

生长素是植物的重要激素之一，它对植物的生长发育有重要的调节控制作用。天然存在的生长素如吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)以及人工合成的生长素类物质如2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、萘乙酸（NAA）等都被广泛应用在科研和农业生产中。这些生长素类物质都含有一个羧基基团（-COOH）。在植物体内，该羧基上的羟基可与葡萄糖以共价键结合，从而形成生长素的糖酯。生长素的糖酯被认为是生长素的失活形式和贮藏形式（Bartel,1997)。当前，生长素的糖酯常作为标准品被用在生长素糖基化修饰等科学研究中。在化学和生物技术产业，获得生长素糖酯的途径主要有两种：从植物中提取和化学合成。由于在植物中生长素糖酯的天然含量很低，提取量非常有限，纯度难以保证，并且提取过程复杂。如果用化学方法合成，也有过程复杂、成本高、环境污染等缺点。相比之下，生物酶法合成生长素糖酯化合物则具有效率高、成本低、环境清洁等优点。

植物体内有一类酶，被称为糖基转移酶，它们专门负责植物体众多化合物的糖基化修饰，即催化某些化合物形成相应的糖酯（或糖苷）。糖基化是一种普遍的生理现象，是植物细胞维持代谢平衡的主要机制之一，在维持植物正常生长发育、应对环境压力等方面具有重要的作用(Lim et al，2004;王军等，2009)。到目前为止，生物界存在的糖基转移酶按照催化的底物性质和序列相关性可以分为94个家族。其中家族1（GT1）的酶所催化的底物是一些亲脂性的小分子化合物，在其-OH、-COOH、-NH₂、-SH或C-C基团上能催化结合上一个或多个糖基(Bowles et al.2005)。

针对生长素糖酯化合物的合成，目前已经从拟南芥发现了一个糖基转移酶，即UGT84B1（Jackson et al.2001），该酶对IAA具有最大的酶催化活性。然而，经过检索，目前尚未发现其他的拟南芥糖基转移酶在催化合成生长素糖酯中的作用，特别是拟南芥糖基转移酶UGT74D1在催化合成生长素糖酯中的应用的报道。

发明内容

（1）本发明的目的

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种拟南芥糖基转移酶UGT74D1在催化合成生长素糖酯中的应用。

（2）实现本发明的具体技术方案

本发明所述的拟南芥糖基转移酶UGT74D1在催化合成生长素糖酯中的应用。

其中：

所述糖基转移酶UGT74D1的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。该糖基转移酶是通过糖基转移酶基因UGT74D1在大肠杆菌中表达和纯化后获得的。糖基转移酶基因UGT74D1是通过RT-PCR方法从拟南芥中克隆的。

所述生长素是指吲哚甲酸(ICA)、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丙酸（IPA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）。

本发明提供新的糖基转移酶UGT74D1能够催化多种生长素物质形成糖酯。

将糖基转移酶UGT74D1与生长素之一放于反应管中，按实施例2中所指出的条件进行酶促反应，即可催化合成相应的生长素糖酯。与已经报道的UGT84B1不同的是，本发明所述糖基转移酶UGT74D1对IBA具有最大催化活性。

（3）本发明实施后可能带来的有益效果

本发明是在国内外首次证明拟南芥的糖基转移酶UGT74D1可以催化多种生长素化合物生成其糖酯物质。本发明的公开为体外利用酶催化方法合成这些生长素物质的糖酯物提供了可行的方法。用提取方法或化学合成方法获得生长素糖酯物不仅效率低，而且缺乏专一性。而用糖基转移酶UGT74D1催化方法则可以高效、专一性的合成吲哚丁酸、吲哚丙酸、吲哚乙酸、萘乙酸等相对应的的糖酯（见附图1至附图6）。本发明实施后将为生长素糖酯合成工业带来巨大经济效益。

附图说明

图1.纯化的融合蛋白GST-UGT74D1用SDS-PAGE检测。

其中，M为蛋白质分子量标记；序号1泳道为GST标签蛋白，作为对照；序号2泳道为纯化的GST-UGT74D1融合蛋白，其中有微弱的GST带，是一种在pGEX纯化系统中比较常见的现象。

图2.纯化后的融合蛋白GST-UGT74D1催化吲哚丁酸形成糖酯，催化产物用高效液相色谱（HPLC）分析。