[发明专利]一种叶酸修饰壳聚糖包裹质粒纳米粒子及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物材料的医学基础应用领域，更具体地说，涉及一种叶酸修饰壳聚糖包裹质粒纳米粒子的制备方法。

背景技术

肝癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，根据最新统计，全世界每年新发肝癌患者约六十万，居恶性肿瘤的第三位。原发性肝癌在我国属于高发病，一般男性多于女性。目前我国发病人数约占全球的半数以上，占全球肝癌病人的55%，已经成为严重威胁我国人民健康和生命的一大杀手。

早期肝癌以手术治疗为主，但由于起病隐匿，早期症状不典型且诊断困难，确诊时大多数患者已达到晚期失去手术机会。肝癌对放化疗均不敏感，目前主要依赖介入（TACE）或药物辅助治疗，预后极差。目前已知肝癌的发生发展与转移和多种基因突变、信号转导通路和新生血管增生异常密切相关，这些发病机理为分子靶向治疗提供许多有利的靶点，逐渐成为新的研究靶点。

在肝癌的过继免疫治疗方面，肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）被作为治疗研究领域之一，治疗的方向放在诱导T细胞及NK细胞分泌IFN-γ及促进CTL成熟，并且诱导更强的抗血管效应。但这种疗法也有其缺陷性，原因是靶向到肿瘤局部的特异性CTL细胞数量有限，影响到免疫治疗的效果。故人们开始研究一种基于趋化因子干扰素诱导蛋白10（IP10），作为促进T细胞的定向趋化和活化增殖的促进剂。

IP10具有强大的趋化淋巴细胞和活化功能，可以定向募集T淋巴细胞并促进淋巴细胞活化和增殖，引起肿瘤内淋巴细胞浸润，并且具有抑制肿瘤新生血管生成的作用，从而发挥较强的抗肿瘤作用。在借助IP10的趋化作用下，CTL即可从注射部位靶向富集到肿瘤周围特别是侵润的肿瘤细胞周围，故目前主要通过转基因技术或者直接肿瘤局部多点注射等方法使肿瘤局部富集IP10。但这些方法存在靶向性、浓度以及体内降解等问题，不能很好的富集到肿瘤细胞局部。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有肝癌的过继免疫治疗中药物靶向性较差的缺陷，提供一种叶酸修饰壳聚糖包裹质粒纳米粒子及其制备方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：构造一种叶酸修饰的壳聚糖包裹质粒纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

S1、将脱乙酰度大于95%的壳聚糖粉末溶解在含1%的醋酸溶液中，制备成5mg/mL的壳聚糖溶液，并调节pH值至4.9-5.2；在持续匀速搅拌作用下，将2mg/mL的三聚磷酸钠溶液按照1.0:(1.2-2.0)的体积比逐滴滴入所述壳聚糖溶液中，形成物理交联后的壳聚糖溶液；

S2、在持续匀速搅拌作用下，将5wt%的戊二醛溶液按照1:12-15的体积比逐滴加入到所述物理交联后的壳聚糖溶液中，37°C水浴震荡过夜，得到化学交联后的壳聚糖溶液，并加入过量的NaBH4粉末；

S3、对步骤S2制得的壳聚糖溶液进行透析纯化，得到壳聚糖纳米粒子悬浮液；

S4、用磷酸缓冲液将叶酸配成5mg/ml的叶酸溶液；将所述叶酸溶液、壳聚糖纳米粒子悬浮液以及1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐按质量比为10:1:5混合，在匀速搅拌作用下，室温反应30min；透析去除未反应的叶酸，得到叶酸修饰的壳聚糖纳米粒子悬浮液；

S5、将IP10质粒用25mmol/L的Na₂SO₄溶液稀释至1mg/ml后与所述壳聚糖纳米粒子悬浮液分别置于55°C水浴5-20min，按质量比为10:1迅速混合后，在涡轮振荡器上以2000rpm的震荡速率震荡30-50秒，室温下静置30min；并在4°C下>10,000g离心20min，然后用磷酸缓冲液重悬，形成乳白色悬液，制得叶酸修饰的壳聚糖包裹质粒纳米粒子。

在根据本发明所述的叶酸修饰的壳聚糖包裹质粒纳米粒子的制备方法中，所述步骤S1中用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至4.9-5.2，所述持续匀速搅拌为500rpm，所述逐滴滴入为1滴/秒的速率。

在根据本发明所述的叶酸修饰的壳聚糖包裹质粒纳米粒子的制备方法中，所述步骤S2中所述水浴震荡的震荡速率为120rpm。

在根据本发明所述的叶酸修饰的壳聚糖包裹质粒纳米粒子的制备方法中，所述步骤S3中透析纯化使用的透析袋的截留分子量为8000-14000，透析时间为2小时。

在根据本发明所述的叶酸修饰的壳聚糖包裹质粒纳米粒子的制备方法中，所述步骤S4中所述匀速搅拌的速度为200rpm；所述透析去除未反应的叶酸使用截留分子量为8000-14000的透析袋。