[发明专利]猪圆环病毒ORF2基因原核表达分泌蛋白的纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪圆环病毒ORF2基因原核表达分泌蛋白的纯化方法，属于疾病免疫技术领域。

背景技术

猪圆环病毒病（PCV）是由猪圆环病毒2型（PCV2）引起的猪传染性疾病，是继猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）之后新发现的又一重要疫病。感染猪可自鼻液、粪便等废物中排出病毒，经口腔、呼吸道途径感染不同年龄的猪，可通过水平传播和垂直传播。猪圆环病毒病临床表现为渐进性消瘦或生长迟缓，并可引起免疫抑制，导致混合感染，死亡率高达25%-40%。自1997年Clark等首次分离到猪圆环病毒2型（PCV2）以来，该病已给全世界养猪业造成了巨大的经济损失。2008年第20届国际猪病大会（20th IPVS）上，人们更将其列为当前危害养猪业发展的头号疫病。我国自2000年报道猪群中存在PCV2感染的血清学证据以来，各地区陆续报道，流行范围已波及全国，猪群平均阳性率38.47%，猪场阳性率58.75%以上，危害日趋严重。

猪圆环病毒2型基因组编码11个阅读框，即ORF1-ORF11，各阅读框大小相差悬殊，而ORF1和ORF2是其两个主要的阅读框。其中ORF1编码与病毒复制相关的Rep蛋白，该蛋白氨基酸序列比较保守；ORF2基因编码病毒的主要结构蛋白Cap蛋白，是临床分子水平上鉴定PCV2的重要基因。ORF2蛋白不仅可以自我装配成病毒衣壳样颗粒，而且可以与PCV2的多抗反应，成为目前研究的热点。而ORF2蛋白的获取多是通过原核、真核及酵母表达系统来实现，但是所得到的ORF2蛋白多是以包涵体形式呈现，不仅增加了蛋白复性的难度，而且增加了生产成本，因此ORF2蛋白的纯化技术均是建立在包涵体基础之上的，目前尚无针对分泌性表达的ORF2蛋白的纯化技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪圆环病毒ORF2基因原核表达分泌蛋白的纯化方法。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案提供一种猪圆环病毒ORF2基因原核表达分泌蛋白的纯化方法，具体步骤如下：

1）取菌体，超声波破碎，离心，取上清液；

2）上样，缓冲液A洗去层析柱中未结合蛋白；

3）依次用缓冲液B1、B2、B3、B4、B5和B6洗去杂质蛋白；

4）依次用缓冲液C1、C2、C3、C4、C5、C6、D1、D2和D3洗脱目的蛋白，即得含目的蛋白的流穿液。

所述的缓冲液A为：

0.2M Na₂HPO₄

0.2M NaH₂PO₄

0.15MNaCl。

所述的缓冲液B1为：

0.2M Na₂HPO₄

0.2M NaH₂PO₄

0.15M NaCl

5mM 咪唑。

所述的缓冲液B6为：

0.2M Na₂HPO₄

0.2M NaH₂PO₄

0.15M NaCl

80mM 咪唑。

所述的缓冲液C4为：

PH7.0

0.2M Na₂HPO₄

0.2M NaH₂PO₄

0.15M NaCl。

所述的缓冲液D2为：

PH7.0

0.2M Na₂HPO₄

0.2M NaH₂PO₄

0.15M NaCl

200mM 咪唑。

咪唑浓度为5mM和80mM的缓冲液B1和B6能有效去除杂质蛋白。

缓冲液D2洗脱目的蛋白的纯度为85%。

本发明针对分泌性表达的ORF2蛋白纯化处理，克服了包涵体形式的ORF2蛋白复性困难，成本较高的缺点。本发明操作方便，工艺简单，提取的分泌性表达ORF2蛋白纯度可达85%，且与猪圆环病毒抗体发生特异性结合，具有良好的反应活性，为猪圆环病毒ORF2基因分泌蛋白的开发奠定了基础。

附图说明

图1显示为变性条件下pH值梯度洗脱SDS-PAGE图

泳道1：相对分子质量蛋白质marker；