[发明专利]一种冬虫夏草菌中国被毛孢的原生态分离法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种冬虫夏草无性阶段的真菌—中国被毛孢的原生态分离法。

技术背景

冬虫夏草是药食同源的稀有珍品，数百年一直与天然的人参、鹿茸相媲美，在国内外享有盛誉。它不温不燥，特别适合老、少、病、弱、虚者，可常年服用，具有补肺益肾和返老还童之功效，而无副作用。但是，由于其天然资源匮乏，价格贵过黄金，各种虫草相继充诉于市场，鱼目混珠，真假难辨。

为了解决供求矛盾，国内外许多科学家进行了大量的研究。研究表明，冬虫夏草为麦角菌科虫草属真菌，冬虫夏草菌[Cordyceps Sinensis(berk.)Sacc.]是寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合物。简单地说，冬虫夏草就是由昆虫和真菌联合而生。而虫草属真菌发现的有几百种，我国记录的也有68种，因此，有一些学者把凡是由虫草属真菌寄生并产生子实体的菌物结合体通称为虫草。然而，近20年来，通过分子生物学和生物还原法，证明了中医药所论述的冬虫夏草仅分布于青藏高原高海拔的严寒地区。特别是青海玉树的冬虫夏草，更具有代表性。它的生长过程经历了无性阶段到有性阶段。而无性阶段的菌种，只有中国被毛孢与冬虫夏草DNA指纹图谱相似率高达96 %（李增智等，确证冬虫夏草无性型的分子生物学证据，菌物系统，19（1）60-64，2000）。现在，学术界普遍认为中国被毛孢是冬虫夏草菌唯一的无性型（刘锡琎等，冬虫夏草无性阶段的分离和坚定，真菌学报，1988,8（1）,35-40）。而在市面出现的 “人工冬虫夏草”尤其是所谓深层发酵生产的“冬虫夏草”，几乎都不是冬虫夏草菌中国被毛孢。由于冬虫夏草僵虫体及其子座营养丰富，常有多种其他菌类寄生或腐生，如果分离材料选择不当或分离方法不正确，经常可能培养生长出不同种类的真菌。尤其象中国被毛孢菌这样在人工培养基上生长缓慢的菌种，很可能为生长快速的其它真菌所掩盖。所以，要获得纯正的冬虫夏草菌种并采用深层发酵方法生产冬虫夏草是非常困难的。

虽然，自80年代沈南英先生第一个申请中国被毛孢分离法专利（专利号CN85101971A）以来，有很多关于人工培养冬虫夏草和对冬虫夏草菌丝体的液体深层发酵培养的报道和相关的专利出现，但是，迄今为止，所有的公开的中国被毛孢的分离方法都过于复杂，难度大，尤其是人工培养基，与天然的原生态冬虫夏草寄主蝙蝠蛾昆虫相比，存在较多缺陷，再加上培养参数模糊、染菌率高，实际上很难推广。

一般来说，菌种分离有三种方法：子囊孢子分离法、组织分离法、基内菌丝分离法。相对来说，采取前两种分离方法，比较容易得到纯的中国被毛孢。中国被毛孢的子囊孢子分离法是利用冬虫夏草菌成熟的子囊孢子萌发菌丝，来获得中国被毛孢纯种的一种方法。业界所采用的子囊孢子分离法比较复杂（张永杰等，分离自冬虫夏草可培养真菌的多样性研究，2010年，菌物学报），因而多采用组织分离法。中国被毛孢的组织分离法是利用新鲜冬虫夏草的子实体的幼嫩组织，在适宜的培养基和生长条件下，促使它恢复到菌丝生长阶段，长成没有组织分化的菌丝体，从而获得中国被毛孢纯种的一种方法。所谓纯种其实与冬虫夏草的采集地有关，除了少数人采集的是青海玉树的冬虫夏草，大部分的都是四川的。从分子生物学来说，它们相差不大，相似性应该达到96%以上。但从品质上说，它们确实有差别。所以，种源是决定中国被毛孢菌种优劣的重要因素。当然，采用什么培养基，在什么条件下才能培养得到纯种中国被毛孢也是很重要的。到目前为止，所公开的文献包括专利，培养基都是人工合成的，所使用的碳源和氮源不尽一致，比例也各不相同，配制方法相对于天然培养基都比较复杂。在培养条件方面，所述参数范围大，例如，培养温度的控制，有的是5～20℃（沈南英，专利公开号CN85101971A），有的是10℃左右（俞永信专利公开号CN1031393A，）有的是在5.6～9.2℃（杨跃雄等，虫草菌感染虫草蝠蛾幼虫的研究，1989年，动物学研究）。在控制杂菌生长的关键环节上，所述也比较模糊，例如，消毒环节上，沈南英石用0.1%的氯化汞对虫体表面消毒5分钟，而朱佳石的实验则是消毒7～10分钟（冬虫夏草成熟过程中中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉DNA共存及竞争增殖力、化学成分变化，2007年，菌物研究），尹定华则采用75％酒精对虫体表面消毒（专利公开号CN102283022A）。然而，大量的实验证明，采用75％酒精表面消毒，2～3天即长出大量杂菌，根本无法汰除，使中国被毛孢菌的生长被掩盖；即使采用浓度0.1％氯化汞对它们进行表面消毒10分钟，仍然有少量杂菌生长，给后续分离工作带来困难。这样且不说是否能真正分离得到中国被毛孢，其菌种质量的优劣也可想而知。

发明内容