[发明专利]一种筛选大蒜抗叶枯病体细胞突变体的方法

权利要求书

1.一种筛选大蒜抗叶枯病体细胞突变体的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）以大蒜茎盘为外植体，分别接种在粗毒素体积分数分别为0％、10％、20％、30％、40％的筛选培养基上，确定筛选压；(2)以大蒜茎盘为外植体，在 MS+B₅有机+2,4-D 2.0 mg/L +KT 0.5 mg/L +5％毒素的培养基上培养30天，诱导出抗性胚性愈伤组织；(3)将诱导出的抗性胚性愈伤组织逐次接种到粗毒素体积分数分别为5％，10%，15%，20%，25%的愈伤组织增殖培养基MS+B₅有机+2,4-D 0.5 mg/L+KT 1.0 mg/L上，以利用多步法筛选抗性胚性愈伤；（4）将步骤3中所得到的抗性胚性愈伤接种至不含毒素的增殖培养基中，使筛选到的抗性胚性愈伤恢复生长；（5）将步骤4中抗性胚性愈伤组织接种到含25％粗毒素的芽分化培养基MS+KT 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L上，促使芽分化，获得抗性芽；（6）将得到的抗性芽接种至无毒素的芽分化培养基上，使抗性芽恢复生长；（7）将得到的抗性芽接种至无激素的MS基本培养基上诱导生根，使其继续长成具有根、茎、叶的完整再生植株；（8）用SSR和SRAP标记对抗性植株进行分子标记鉴定。

2.根据权利要求1所述的一种筛选大蒜抗叶枯病体细胞突变体的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的大蒜选择健康饱满的蒜瓣，去皮，在自来水下冲洗1h，后在无菌条件下用75％酒精浸1min，再用0.5％次氯酸钠消毒20～25min，无菌水冲洗4～5次待用，在超净工作台上切去蒜瓣上部的贮藏叶，剩下约5mm厚带发芽叶基的茎盘，十字切成4块为外植体，分别接种在粗毒素体积分数分别为0％、10％、20％、30％、40％的筛选培养基上，接种时使外植体伤口与培养基表面充分接触，培养条件为：温度20～25℃，光照2000Lx，14h光照/10h黑暗条件下培养30天后，根据各处理愈伤组织诱导率及发育状况，确定适宜的抗性筛选压为25％。

3.根据权利要求1或2所述的一种筛选大蒜抗叶枯病体细胞无性系的方法，其特征在于：所述步骤（2）的具体方法为：以大蒜带发芽叶基的茎盘为外植体，接种在含粗毒素为5％的MS+B₅有机+2,4-D 2.0 mg/L +KT 0.5 mg/L的培养基上，培养30天，得到抗性胚性愈伤组织。

4.根据权利要求3所述的一种筛选大蒜抗叶枯病体细胞无性系的方法，其特征在于：所述步骤（3）的具体方法为：配置附加不同体积分数的粗毒素增殖培养基MS+B₅有机+2,4-D 0.5 mg/L+KT1.0 mg/L，粗毒素按每5％为一个梯度，直至粗度素体积分数为25％，分别将抗性愈伤组织接种到上述粗毒素的增殖培养基上，使胚性愈伤组织增殖，每30天为一个培养周期。

5.根据权利要求4所述的一种筛选大蒜抗叶枯病体细胞突变体的方法，其特征在于：所述步骤(5)的具体方法为：将所得到的抗性愈伤组织接种至粗毒素分数为25％的MS+KT 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L的芽分化培养上，培养30天，获得抗性芽。

6.根据权利要求5所述的一种筛选大蒜抗叶枯病体细胞突变体的方法，其特征在于：所述步骤(8)的具体方法为：对所得到部分再生植株利用SSR 和SRAP标记手段进行分子鉴定。