[发明专利]一种鱇浪白鱼心脏细胞系的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鱇浪白鱼心脏细胞系的构建方法，属于淡水生物细胞培养技术。

背景技术

鱇浪白鱼Anabarilius grahami隶属于鲤形目Cypriniforms、鲤科Cyprinidae、白鱼属Anabarilius，俗称白鱼，是仅产于云南抚仙湖的珍稀鱼种，是云南四大名鱼之一。此鱼肉细嫩鲜美，软刺薄鳞，清香可口。该鱼曾是抚仙湖的主产鱼种，多年来，由于外来鱼种入侵，以及水质恶化，捕捞过度，已处于濒危边缘。虽然1999年以来，中科院昆明动物研究所人工繁殖成功，保护并挽救了这一珍稀鱼种，使其近年产量保持平稳。但野生种群仍在锐减，且并未给出基于鱇浪白鱼自身的种群衰减原因。而细胞系的建立可望作为环境毒理学研究环境污染物的模型，对淡水水体中存在的各种环境污染物，包括基因毒物、致癌物和环境激素等，进行污染检测和安全性评价；还可应用于鱼类病毒的分离、繁殖、病毒疫苗研制，在分子细胞水平寻找种群衰减的原因。

经文献检索，未见与本发明的相同报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便易行的鱇浪白鱼心脏细胞系的构建方法，以弥补现有技术的不足，满足对鱇浪白鱼理论研究以及在环境毒理学中的应用。

本发明的鱇浪白鱼心脏细胞系的构建方法，其具体步骤如下：

a.制备细胞培养液

选择L-15培养基，向培养基中加入胎牛血清、人碱性成纤维细胞生长因子和硫酸软骨素，使胎牛血清的终浓度为20%，人碱性成纤维细胞生长因子的浓度为3 ng/ml，硫酸软骨素的浓度为0.5 μg/ml。pH值为7.0-7.4，置于4℃冰箱中保存，备用；

b.原代培养

先用8 mg/L高锰酸钾浸泡鲜活鱇浪白鱼10 min，对鱼进行整体消毒，以75%酒精再次消毒，置于超净工作台中，用无菌解剖器械取其心脏，置于12孔板中，加入含有抗生素的PBS溶液浸泡心脏组织，其中：青霉素的浓度为200 IU/ml，链霉素的浓度为200 μg/ml，庆大霉素的浓度为100 μg/ml，浸泡20 min后，将心脏组织用PBS+200 IU/ml青霉素+200 μg/ml链霉素+100 μg/ml庆大霉素的溶液清洗三次，剪成组织小块，用0.5%透明质酸酶和0.2%II型胶原酶联合消化30 min，收集心脏组织块，并将其均匀接种于25 cm²细胞培养瓶中，28℃培养箱中，正置干贴过夜，次日加入L-15+20%FBS+3 ng/ml bFGF+0.5 μg/ml硫酸软骨素+100 IU/ml青霉素+100 μg/ml链霉素的培养液5 ml，在28℃培养箱中启动原代培养，每隔3天半量更换培养液，第8天细胞开始迁出，第45天细胞长成单层；

c.继代培养

待细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，用不含抗生素的PBS溶液清洗两遍，加入0.125%的胰蛋白酶1.5 ml，消化2 min，细胞变圆后，加入L-15+20%FBS+3 ng/ml bFGF+0.5 μg/ml硫酸软骨素+100 IU/ml青霉素+100 μg/ml链霉素的细胞培养液8.5 ml，用吸管吹打，制成细胞悬液；然后接种于两个新培养瓶内，原贴有心脏组织块的培养瓶亦加入5 ml L-15+20%FBS+3 ng/ml bFGF+0.5 μg/ml硫酸软骨素+100 IU/ml青霉素+100 μg/ml链霉素细胞培养液，在28℃培养箱中培养；以后7天传代一次，传至第2代时，培养液中的抗生素浓度减半，传至第3代时，将培养瓶中的培养液替换成L-15+20%FBS+3 ng/ml bFGF+0.5 μg/ml硫酸软骨素细胞培养液5 ml，传至第8代时，将培养液中血清含量降至10%，此时，细胞系建立成功。

本发明的各步骤中所用的百分比为体积百分比。

本发明的有益效果在于：

1、操作简便易行；

2、构建的鱇浪白鱼心脏细胞系（AGH）细胞生长状态良好，形态为成纤维样细胞，能连续传代40代以上，直接用于环境毒理学研究环境污染物的模型，进行污染检测和安全性评价；还能应用于鱼类病毒的分离、繁殖、病毒疫苗研制。

3、该构建方法也适用于其他鱼类构建心脏的细胞系

具体实施方式

本发明的鱇浪白鱼心脏细胞系的构建方法，该构建方法的具体步骤如下：

a.制备细胞培养液