[发明专利]一种卡特兰组织培养的方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种卡特兰的组织培养快速繁殖方法，属于植物细胞工程技术领域。

二、背景技术

卡特兰是世界上栽培最多，最受人们喜爱的洋兰之一。它花型优美，色彩艳丽，并且有特殊的芳香。一年四季都有不同的品种开花。花期较长，一般可开放2～3周，不仅是珍贵的盆花，还是重要的高档切花。组织培养技术的应用大大促进了卡特兰的规模生产，不仅能加快新品种推广，而且能够获得可观的经济效益。但是卡特兰外植体在初始培养中易褐化死亡，是原球茎诱导成功的一大障碍。目前认为植物组织培养中的褐变主要是由酶促褐变引起，即培养材料变褐主要是由伤口处分泌的酚类化合物引起。选择适当的外植体是克服褐变的最主要的手段，取材时应注意选择分生能力较强的外植体。成年植株比幼苗褐变程度严重，夏季材料比冬季、早春及秋季材料的褐变严重，冬季培养物的存活率明显高于夏秋季节。因此，采芽时机应尽可能避开生长旺盛期。对外植体要充分漂洗，促进酚类物质渗出。培养基的成分与褐变程度有关，要考虑所选培养基的状态和类型，筛选适宜的培养基配方。在组织培养过程中，经常进行细胞筛选，可以剔除易褐变的细胞。在外植体接种1~2天后立即转移到新鲜培养基中，能减轻酚类物质对培养物的毒害作用，使外植体尽快分生，连续转移5~6次，可基本解决外植体的褐变问题。

现有技术方案：切取优良母株的新梢进行茎尖诱导繁育。通过研究，筛选出适合卡特兰茎尖培养及分生苗生长的培养基配方和组培快繁技术。新梢经消毒后，于无菌条件下将外包嫩叶剥至1~2 片，小心切除芽基部，保留生长点内长约2~3cm的茎尖顶端分生组织块，接入茎尖培养基内培养，每瓶放1块。将接种后的培养基置于室温(25 ±2)℃、相对湿度70%~90%、光照强度2000lx条件下诱导培养，经继代培养和生根培养，长成合格分生苗。茎尖诱导培养以配方A. 1/2 MS + BA 2 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 椰乳200 ml/L + 3 %蔗糖和配方B. 1/2 MS + BA 2mg/L + NAA 0.2 mg/L + 3% 蔗糖效果较好，表现为茎尖组织块分生率较高，诱导培养40天后外植体基部分生出较多的愈伤组织和不定芽点，经继代培养，不定芽点逐渐发育长成不定芽，切取的不定芽块转入生根培养，60 天后长成根茎叶齐全、生长正常的分生瓶苗，可出瓶移栽。 

现有技术从茎尖诱导不定芽到分生苗的培养周期较长，可能与卡特兰内源激素的作用和植物体生长发育周期较长有关。茎尖培养极易发生褐变，导致外植体切口组织坏死。需通过以下几个方面的工作减轻外植体的褐变发生：首先，要避免在高温季节采芽，因为高温有利植物体内酚类物质的产生，培养时褐变严重，新芽成活率较低，春秋季是较适宜的采芽季节；其次，需在培养基内单独或混合加入活性炭1g/L、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)5g/L、柠檬酸2g/L 等药剂抑制褐变；再次，培养温度要保持在20～25 ℃，此时培养材料分泌产生的酚类物质较少，室温超过30℃时，褐变物质显著增加，成活率大大降低；此外，暗培养和勤转瓶(15～20 天转1 次) 也能减轻褐化物质对外植体的危害。 

三、发明内容

技术问题

本发明通过切取卡特兰新梢的顶芽和不同部位的侧芽生长点进行液体培养，详细描述了茎尖外植体的切割方法，一个新梢可以切取5个外植体，提高了增殖系数。其次通过适宜的激素配比和液体培养技术，有效解决卡特兰茎尖常规培养方法的外植体褐变现象，提高培养质量。因为酶促褐变如同一般的酶促反应，其发生必须具备三个条件，即酶、底物和氧。液体培养阻断了外植体与氧气的接触，可有效抑制褐变现象，从而简化卡特兰的茎尖培养流程。

技术方案

利用卡特兰新梢顶芽和侧芽分生组织为外植体，通过添加适宜的激素配比和液体培养条件，进行愈伤组织诱导和分化，促进愈伤组织增殖并分化出原球茎，切割原球茎进行继代培养，培养出幼苗，经生根培养长成合格的瓶苗。

具体步骤如下： 

（1） 外植体的选择与灭菌

选6~8厘米长的新梢作外植体，用升汞消毒法进行消毒，分别取新梢上顶芽和侧芽作外植体进行培养，切割顶芽和侧芽生长点中心部位的分生组织大小为直径2~4mm。

（2）愈伤组织诱导培养