[发明专利]一种人乳铁蛋白夹心ELISA检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体来说涉及人乳铁蛋白夹心ELISA检测试剂盒及其应用。

背景技术

在转基因生物新品种培育重大专项和国家其他经费的资助下，我国转基因猪、牛和羊新品种研发获得了蓬勃发展，多个转基因动物品种展示了良好的产业化前景，其中发展最为迅速的是乳腺生物反应器的利用，目前转人乳铁蛋白基因奶牛已经通过了农业部规定的中间试验、环境释放、生产性试验，距离获颁最终的农业转基因生物安全证书仅有一步之遥。

由于转基因生物及其产品存在风险，转基因生物及产品的管理一直受到各国政府的高度重视。牛奶和奶制品是人们餐桌上最常见的一类食物，食品安全直接关系民生，在没有足够的数据证明其安全之前，质检机构均有责任和义务去检测和监测这些已上市或即将上市的转基因产品。开发一种实用、灵敏、特异的人乳铁蛋白成分检测试剂十分必要。

目前用于检测乳铁蛋白的方法主要有高效液相色谱法、毛细管电泳法、放射性免疫法和酶联免疫吸附法等，但是检测人乳铁蛋白的报道却并不多。王燕平等建立了一种人乳中乳铁蛋白ELISA检测方法，为间接ELISA法，摸索了ELISA操作的工作条件，检测人乳铁蛋白的限度为1.56~100ng/mL。该方法针对标准品检测灵敏度高，但针对样品的检测灵敏度低。双抗体夹心ELISA又称抗原捕捉ELISA，该方法已被大量用于动物疫病的临床诊断，该方法最关键的条件是制备高纯度的包被抗体，纯度越高，则特异性越好，但尚无人乳铁蛋白转基因成分双抗体夹心ELISA检测方法的报道。

发明内容

本发明目的是提供一种人乳铁蛋白夹心ELISA检测试剂盒用于定量检测转基因成分。

本发明另一目的是提供人乳铁蛋白夹心ELISA检测试剂盒检测人乳铁蛋白的方法。

本发明再一目的是提供人乳铁蛋白夹心ELISA检测试剂盒在检测转基因牛奶及奶制品中人乳铁蛋白含量中的应用。

本发明提供的人乳铁蛋白的夹心ELISA检测试剂盒，包括包被抗体和酶标抗体，其中所述包被抗体为人乳铁蛋白多克隆抗体，所述酶标抗体为人乳铁蛋白单克隆抗体。

其中，所述人乳铁蛋白单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.6394的杂交瘤细胞株分泌获得。

用重组蛋白hLF免疫雌性BALB/c小鼠，取脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，经ELISA法进行阳性克隆筛选、通过有限稀释法进行亚克隆，获得稳定分泌抗hLF的4株细胞1C2、2G11、3A6、3D12。取杂交瘤细胞（效价较高同时细胞状态好）注射至小鼠腹腔，收集腹水，亲和柱纯化得单克隆抗体。

经鉴定腹水制备前细胞上清效价检测显示细胞3D12效价最高。3D12细胞亚型为IgG1+kappa。3D12细胞能与免疫原hLF反应，不与筛选原牛乳铁蛋白（bLF）反应。用细胞3D12制备腹水，检测腹水效价为1:81000，腹水纯化检测单克隆抗体效价为1:81000，抗体纯度高于95%。

杂交瘤细胞ZZY hLF 3D12的保藏号为：CGMCC No.6394；保藏时间：2012年7月20日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

所述人乳铁蛋白单克隆抗体可用于检测转基因牛奶中表达量数量级为g/L的人乳铁蛋白。Western Blot检测显示抗体3D12只与转基因牛奶及奶粉反应，不与非转基因牛奶及奶粉反应。

其中，所述酶标抗体的标记酶为辣根过氧化物酶。

其中，所述人乳铁蛋白多克隆抗体是以人乳铁蛋白作为免疫抗原，分批次免疫正常家兔，加强免疫后7天收集血清，分离纯化得到。

纯化抗体通过考马斯亮蓝验证，多克隆抗体能满足要求，浓度约为2mg/mL。采用间接ELISA法对抗体IgG进行鉴定，抗体效价达到1∶200,000。

其中，检测样本中免疫抗原检测限为25ng/mL。

所述人乳铁蛋白的夹心ELISA检测试剂盒还包括以下试剂中的一种或几种：

1）洗涤液；

2）底物显色液；

3）反应终止液；

4）人乳铁蛋白标准品。

所述洗涤液为PBST，所述底物显色液为TMB，所述反应终止液为2mol/L H₂SO₄。

所述试剂盒检测人乳铁蛋白的方法，包括如下步骤：

1）向包被人乳铁蛋白多克隆抗体的酶联板中加入人乳铁蛋白抗原标准品和待检测样品，洗涤液洗板；