[发明专利]一种用于保存胚胎的冷冻液、其制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于保存胚胎的冷冻液，特别涉及一种用于保存取样胚胎的冷冻液。本发明还涉及所述冷冻液的制备方法及应用。

背景技术

胚胎的冷冻是胚胎的保存方法，将胚胎置于冷冻液中保护并采取特殊的降温程序，使胚胎在超低温（液氮-196℃，液氦-269℃）下停止代谢。需要使用胚胎时，再通过特定的解冻程序使其恢复生存能力，从而达到长期保存胚胎的目的。

为了性别鉴定和其它基因检测与分析，常常需要利用显微操作技术将胚胎组织切割下一小部分用于分析，将剩余部分冷冻保存备用。

但胚胎被切割取样后会对胚胎造成损伤，如透明带破损、胚胎细胞数量减少、破坏细胞连接等，使胚胎对冷冻的耐受性降低。冻后的胚胎无论在形态正常率、冻后回收率，还是在胚胎发育率等方面都不够理想。

冷冻液主要包括两种：慢速程序化冷冻液和玻璃化冷冻液。常规冷冻就是慢速程序化冷冻，慢速程序化冷冻液的组成和配比不是固定不变的，目前最常用的是乙二醇+蔗糖或者再添加些其他成分的，一般在牛胚胎的冷冻上研究较多。由于胚胎的质量、种属、发育阶段和培养条件的不同，使得冷冻效果存在差异，冷冻液的组成也会随之变化，但用于保存取样胚胎的效果较好的冷冻液鲜有报道。

1983年Lehn-Jensen发现透明带在冷冻解冻过程中起一种物理屏障作用，可抵抗病毒和微生物。目前，针对取样胚胎冷冻的报道较少，且有关的报道，冷冻效率都很一般。而常规的由乙二醇和蔗糖组成的乙二醇冷冻液，由于冷冻保护剂选择不当，大都存在冷冻取样胚胎效率低以及取样胚胎冻后的发育率和移植成功率较低的问题。因此，急需一种可保存取样胚胎的冷冻液。

聚蔗糖（商品名Ficoll）以蔗糖和环氧氯丙烷为原料，目前对于将聚蔗糖加入常规乙二醇冷冻液的报道非常少，且在常规冷冻保护液中添加高分子量非渗透性抗冻保护剂，此前从未有过报道。

发明内容

为解决上述领域的需求和不足，本发明提供一种用于保存胚胎的冷冻液，其制备方法及应用。本发明冷冻液通过在常规胚胎冷冻液中添加特定浓度的高分子量非渗透性抗冻保护剂聚蔗糖，解决了常规乙二醇冷冻液用于冷冻取样胚胎发育率低的问题。

一种用于保存胚胎的冷冻液，含乙二醇和蔗糖，其特征为还含有聚蔗糖、含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS，其配比为：

聚蔗糖9～65g:乙二醇75～85ml:蔗糖30～40g:含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS 910～930ml；

所述含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS中，所述牛血清白蛋白在缓冲溶液中的含量为0.0021g/ml；

配制时，将乙二醇、蔗糖和聚蔗糖溶解于含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS中。

当所述冷冻液各组分的配比为:聚蔗糖9.2～64.4g:乙二醇80ml:蔗糖30～32g:含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS 920ml时，本发明冷冻液胚胎发育率数值大于对照组的胚胎发育率，根据本领域常识，本发明冷冻液总体效果优于对照组。

当所述冷冻液各组分的配比为:聚蔗糖9.2～55.2g:乙二醇80ml:蔗糖30～32g:含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS 920ml时，根据对比数据，本发明冷冻液总体效果较佳,这个区间内的冷冻液效果差异不显著，且冷冻效果比较稳定，没有忽高忽低的变化。

当所述冷冻液各组分的配比为:聚蔗糖46～55.2g:乙二醇80ml:蔗糖30～32g:含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS 920ml时，冷冻效果达到较好，冷冻效果优于这个范围外的冷冻液，将聚蔗糖的浓度提高或者降低，则都不能达到如此好的效果，所以从本发明数据来看，常规冷冻液中，添加聚蔗糖的相对最适量范围为46～55.2。

所述冷冻液各组分的最佳配比为:聚蔗糖0.552g，乙二醇0.8ml，蔗糖0.315008g，含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS 9.2ml，在这个比值下，本发明冷冻液效果最好。

上述冷冻液中，所述胚胎是经切割取样的取样胚胎。

上述冷冻液的制备方法，包括如下步骤：

（1）将聚蔗糖加入容器中，加入缓冲溶液PBS，4℃静置溶解；

（2）再加入蔗糖，4℃静置溶解；

（3）再加入牛血清白蛋白BSA，勿摇动，4℃静置溶解；

（4）再加入缓冲溶液PBS，得到的混合液；

（5）取步骤（4）所得混合液同乙二醇相混合，密封，4℃冰箱静置；