[发明专利]一种载脂蛋白B的快速纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉载脂蛋白的纯化方法，尤其涉及一种载脂蛋白B的快速纯化方法。

背景技术

载脂蛋白B是低密度脂蛋白胆固醇（LDL-CHOL）的主要结构蛋白，约占LDL-CHOL总蛋白含量的97%，载脂蛋白B的测定可直接反映LDL-CHOL的水平。载脂蛋白与脂类结合在一起，组成类似微胶束的球体，载脂蛋白在其中起到稳定球体结构和脂类转运的功能。载脂蛋白B与脂类组成的胶体球被称为低密度脂蛋白，直径为普通蛋白质20~40倍。载脂蛋白B被认为是动脉粥样硬化的危险因素，测定其浓度对动脉粥样硬化，心血管疾病的判断和预测提供有价值的指标，具有重要的诊断和预防意义。临床用以测量载脂蛋白B浓度的方法主要是免疫比浊法，需要消耗大量的载脂蛋白B及其多克隆抗体血清。

当前，载脂蛋白B的纯化方法包括高速梯度离心法、右旋硫酸葡萄糖苷沉淀法和高效液相色谱法等。高速梯度离心法存在处理量小，纯化效率低，纯化成本高的缺点。高效液相色谱法存在需要昂贵的设备以及熟练的操作人员，纯化成本高的缺点。右旋硫酸葡萄糖苷沉淀法是当前常用的纯化方法，但该方法存在试剂昂贵；操作繁琐，长时间透析，增加了纯化成本，延长了生产周期；纯化产品降解片段多，纯度不够高；且由于目前右旋硫酸葡萄糖苷沉淀载脂蛋白B的原理尚不明确，沉淀不能重新解离，即得到的沉淀为不可逆沉淀，沉淀复合物中载脂蛋白B的理化性质发生改变，严重干扰载脂蛋白B的进一步纯化。

因此，开发载脂蛋白B的简单快速纯化方法，对于降低载脂蛋白B和其抗体的制备成本具有重要意义。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，发明人在载脂蛋白B的纯化方面进行了大量的探索，预料不到地发现，通过热稳定性差异发展而来的两次加热沉淀技术可实现人血浆中载脂蛋白B的快速高效纯化，且具有操作步骤简单，无需昂贵设备，纯化后的产物纯度高，纯化得率高，可有效降低纯化成本的优点，从而实现本发明。

本发明提供一种载脂蛋白B的快速纯化方法，包括如下步骤：

A）  取人血浆，加入缓冲溶液稀释并混匀后得到稀释血浆样品；

B） 将所述稀释血浆样品置于65~75℃的第一水浴中加热，期间每隔5分钟轻轻混匀所述稀释血浆样品一次，以避免发生共沉淀，从而提高了载脂蛋白B的纯化得率；水浴加热15~25分钟后，将所述稀释血浆样品于7500~8500g条件下离心10~20分钟，取上清液；

C） 往所述上清液中加入0.5~3%体积分数的表面活性剂，混匀后静置3~5小时，得到处理后的上清液；

D）  将所述处理后的上清液置于50~60℃的第二水浴中加热，期间每隔5分钟轻轻混匀所述处理后的上清液一次，以避免发生共沉淀，从而提高了载脂蛋白B的纯化得率；水浴加热10~30分钟后，将所述处理后的上清液于7500~8500g条件下离心10~20分钟，弃上清液，收集沉淀；

E） 将所述沉淀用0.01~0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液洗涤两次，抽滤，得到纯化后的载脂蛋白B。

采用上述技术方案，通过第一水浴的加热，使一些杂蛋白受热变性沉淀得以去除，而载脂蛋白B与脂类形成的低密度脂蛋白具有大的体积和更加复杂的胶体球结构，内部有更多的维持高级结构的分子间作用力，能耐受第一水浴的温度；当使用表面活性剂破坏低密度脂蛋白的胶体球结构后，被释放出来的载脂蛋白B无法耐受第二水浴的温度从而变性沉淀，沉淀经Tris-HCl缓冲液洗涤后，得到纯化后的载脂蛋白B。因此，本发明提供的载脂蛋白B的快速纯化方法操作步骤简单，主要为两次水浴加热、两次离心和一次表面活性剂处理步骤；所需设备简单，主要为水浴锅和离心机设备；纯化后的产物纯度高，纯化得率高，有效降低了载脂蛋白B的纯化成本。

作为本发明的进一步改进，所述缓冲溶液采用pH为5.0~6.5的磷酸缓冲溶液，可以保持载脂蛋白B的稳定，防止其提前变性。

作为本发明的进一步改进，所述第一水浴的温度为70℃，可使血浆中的大部分杂蛋白变性沉淀，且不会对低密度脂蛋白的胶体球结构造成影响。

作为本发明的进一步改进，所述表面活性剂采用曲拉通X-100，可破坏低密度脂蛋白的胶体球结构，从而释放出载脂蛋白B，且不会对载脂蛋白B的结构造成影响。

作为本发明的进一步改进，所述第二水浴的温度为55℃，可使载脂蛋白B变性沉淀，且不会导致其他蛋白的变性沉淀。