[发明专利]一种海水养殖环境中异养硝化脱硫细菌的筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于海水养殖环境中细菌筛选领域，特别涉及一种海水养殖环境中异养硝化脱硫细菌的筛选方法。

背景技术

自20世纪80年代以来，由于海洋渔业资源的锐减使得海水养殖业得到迅猛发展，全球的海水养殖每年以10％的速度增加。我国的海水养殖业在养殖面积、放养种类以及产量等方面也得到了很大的发展。然而，大规模发展海水养殖使得近岸大量水面被围拦或密置网箱，水体超负荷运载。由于网围精养采取高密度放养，需投喂大量外源性饵料、肥料等，致使水中氮、磷含量猛增，透明度下降，水质恶化，底质污染严重，水体富营养化加重，病害逐年加重，赤潮频发。随着此项产业的发展，使局部养殖海域的水环境质量受到严重影响。养殖业的自身污染已经开始制约渔业生产的持续健康发展。

海水养殖区的沉降量比非养殖区大得多。季如宝等在对贝类养殖的海湾生态系统研究中指出，在贝类密集区，生物的沉降作用非常明显。Hatcher等人在加拿大Upper South Cove贻贝养殖区进行了测定，发现养殖区的沉降量往往是非养殖区的2倍以上。在瑞典的某一贻贝养殖区，每个养殖季节结束后底质增厚10cm左右。水产养殖区的底泥中，碳、氮、磷的含量比周围水体沉积物中要高，耗氧量亦高，沉积物中经常可见残饵。当底泥堆积的有机物过多时将导致底质理化指标的改变，微生物的分解作用旺盛，底泥溶解氧不足，因缺氧或无氧而成为还原态；海水中含有大量的硫酸盐，在还原环境中生成H₂S，并且由于沉积物的吸附作用，可以渗透扩散到底层数厘米深。

所以，海水养殖水质和沉积物环境质量改善是目前急需解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种海水养殖环境中异养硝化脱硫细菌的筛选方法，该方法操作简单，效果直观可靠，所分离菌株可以利用铵态氮为唯一氮源的培养基进行生长，并且可以耐受高盐度的海水养殖环境，对养殖水体中的铵态氮乃至养殖水体和沉积物中的硫化物具有良好的去除效果。

本发明的一种海水养殖环境中异养硝化脱硫细菌的筛选方法，包括：

（1）配制分离异养硝化细菌用培养基，于121℃下灭菌15-20分钟，待培养基冷却至45～50℃后倾倒至灭菌的培养皿中，静置冷凝成平板；将海水养殖环境中水样或者沉积物样品与无菌海水混合得到稀释液或均匀悬浊液，将稀释液或均匀悬浊液再与无菌海水按体积比1:9进行梯度稀释，稀释6-7次，得到不同浓度的稀释液；将每一浓度的稀释样品在上述平板上摊开，干燥，静置冷凝后，30℃下培养3-4天；在形成菌落的平板上，挑取单个菌落按照上述方法再重复2-3次，即可得到经分离纯化后的异养菌株；

（2）在步骤（1）中得到的平板上以点接种方式接种上述异养菌株，30℃下培养3-4天后，形成单菌落后，用格利斯试剂点滴于菌落上，挑取菌落周边红色深的，作为硝化能力复核用的供试菌株；

（3）将由步骤（2）筛选出的供试菌株用接种环挑取一菌环菌苔接种于含唯一碳源的复核用培养基，30℃下培养7-10天，培养期间每隔3天取培养液至洁净试管，将格利斯试剂点滴入试管中进行硝化活性确认，并以不接菌株的培养基作为空白对照，同样选择红色深的菌株作为脱硫细菌筛选用的供试菌株；

（4）将由步骤（3）筛选出的供试菌株用接种环挑取一菌环菌苔接种于脱硫细菌筛选用培养基中，30℃下培养，并同时做不接菌株的空白对照；用碘量法测定培养液中硫化物含量，选择硫化物含量明显降低的菌株作为同步去除铵态氮和硫化物能力测试用的供试菌株；

（5）将由步骤（4）筛选出的供试菌株同样在脱硫细菌筛选用培养基中培养，培养过程中取样，用钠氏试剂比色法测定培养液中铵态氮浓度，并用碘量法测定培养液中硫化物含量，验证供试菌株的同步去除铵态氮和硫化物能力；选择去除铵态氮和硫化物效果好的，即得所需异养硝化脱硫细菌。

所述步骤（1）中的分离异养硝化细菌用培养基的组成为：蛋白胨5g，酵母膏1g，琼脂粉18g，海水1L，pH8.2-8.4。（2116E培养基）

所述步骤（1）中的水样与无菌海水按体积比1:9混合；沉积物样品与无菌海水按质量体积比1g:99mL混合。

所述步骤（1）中的形成菌落的平板具体为每个平板有90-100个菌落。

所述步骤（2）中的单菌落的直径为1.8~2.2mm。