[发明专利]人畜布鲁氏菌抗体免疫层析试纸及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫学诊断检测技术领域，具体步及一种检测布鲁氏菌感染的检测试纸及其制备方法。本发明还涉及布鲁氏菌外膜蛋白bp26和omp31基因工程抗原制备的方法，及其在这两种蛋白在布鲁氏菌抗体检测方面的应用。 

技术背景

布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌属细菌侵入机体后引起的一种人畜共患传染病。布鲁氏菌为兼性胞内寄生菌，人感染后会关节炎、脑膜炎、心内膜炎等表现为持续性感染，目前尚无法根治；动物感染后公畜引起睾丸炎和附睾炎，母畜多发生流产、早产、死胎等是造成畜牧业重大损失的主要原因之一(赵凤菊，2011；文学忠，2007)。全球约有170个国家和地区流行此病，每年新发病例约50万人。近年来，布鲁氏菌病的人畜疫情在世界范围内均出现了回升势头，并呈持续增长态势，愈演愈烈。我国各省市区均有人畜不同程度的布鲁氏菌病流行。根据布鲁氏菌的细菌学特征和感染宿主的亲嗜性，传统上将布鲁氏菌属分为6个种，即牛种布鲁氏菌、羊种布鲁氏菌、猪种布鲁氏菌、犬种布鲁氏菌、绵羊附睾种布鲁氏菌和沙林鼠种布鲁氏菌。 

布鲁氏菌病是一种全身性的疾病，感染后不及时的诊断和治疗多呈现疗程长，预后差、劳动力损失大，卫生消费需求高等特点，给个人、家庭和社会造成极大的经济损失，甚至由此造成的因病致贫，因病返贫现象非常突出，已成为威胁经济发展和社会稳定的重要因素之一。由于没有典型的临床特征，而且在血液中的生长率很低，使得临床诊断往往表现出假阴性结果，并且血清学诊断也受许多条件的干扰和限制[许邹亮，2011]，及时和准确的诊断布鲁氏菌病显得尤为困难。而且在人类布病的临床特征，很容易与梅毒、结核病患者相混淆，并且开始发病时的临床病症多变，因此研究和发展布鲁氏菌病的临床诊断技术对控制布病的流行是非常重要的[张芳毓，钱爱东，2011]。目前实验室常规方法主要是血清学检验，包括有试管凝集试验(SAT)、虎红平板凝集试验(RBPT)、补体结合试验(CFT)。RBPT用于人布鲁氏菌的初筛，其优点为：快速，5min即可判定结果，适用于基层使用[陈泽祥，2009]，其缺点为：①其阳性结果有赖于其他实验确诊；②易产生假阳性，布鲁氏菌与大肠杆菌、小肠耶尔森菌等环境菌有共同抗原，易于发生交叉反应；③易产生假阴性，布鲁氏菌感染存在菌血症时期，血清学不易查出，存在漏检现象；④易于误判，其阳性结果，阴性结果有赖于有经验的医师观察。补体结合试验(CFT)足WHO最早的布鲁氏菌病血清学确诊方法，但由于该方法操作复杂要求条件高不适用于基层，目前临床上常用试管凝集试验(SAT)代替用于确诊布鲁氏菌病患者的诊断，其优点为：较为准确，24h出结果，设备简单，适用于基层实验室诊断，其缺点为：(1)易于与其他病原菌发生交叉反应，产生假阳性；(2)易产生假阴性，布鲁氏菌病感染存在溶血症事情，此期感染血清学不易查出，存在漏诊现象[张德贤，2010；张彦婷，2008；洪林娣，朱明东，2007]。ELISA检测布鲁氏菌病由于其较高灵敏度和特异性近年来受到越来越多的关注。ELISA方法的特异性强， 而且灵敏度也显著提高[C.Romero，1995]。 

然而在基层诊疗机构和畜牧兽医站缺少分子生物学检测与ELISA检测的仪器设备和专业技术人员，而且这两种方式又存在着检测时间长，短时间内难以给出检测结果，在老少边穷地区尤其是布鲁氏菌病高发地区很难推广使用。因此，开发一种具有简单经济、方便快速的检测方式对该病控制治疗显得尤为重要。以免疫层析法为代表的即时检测技术(point of care test，POCT)，由于其小型化的仪器或无需仪器设备、简单的操作和检测报告的即时化，使基层诊疗机构的布鲁氏菌病快速筛查成为了可能。因为简单(试纸条的形式呈现)、快捷(一个测试仅仅需要5min)、经济并且易于使用，免疫层析检测技术已经广泛应用于环境检测；动植物检疫；食品安全；临床诊断等方面。 

发明内容

本发明的目的在于满足我国人畜对布鲁氏菌病防疫的要求，提供一种敏感、特异性强，能够快速诊断布鲁氏菌病和对羊种和牛种布鲁氏菌病分型检测试纸条。本发明的利用各种布鲁氏菌的共同外膜蛋白均有而牛种布鲁氏菌没有的外膜蛋白omp31作为检测线1，将各种布鲁氏菌的共同外膜蛋白bp26作为检测2，将于SPA结合的IgG类抗体作为质控线，用柠檬酸二纳还原氯金酸制备30纳米左右的胶体金作为标记材料，标记金黄色葡萄球菌蛋白A，并喷涂在玻璃纤维膜上制成一种检测人畜血清中布鲁氏菌抗体的检测试纸条。