[发明专利]一种高表达安丝菌素P-3的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物发酵技术领域，具体涉及一种从珍贵橙色束丝放线菌制备安丝菌素P-3的方法。

背景技术

安丝菌素(Ansamitocin)是一种微管蛋白抑制剂。它通过与微管蛋白的结合从而拮抗微管蛋白组装，其作用位点与长春花碱相同。他的细胞毒性传统化疗药物长春新碱、甲氨蝶呤和柔红霉素的100-1000倍。安丝菌素的母核是大环内酯类美登醇，其同系物包括植物来源的美登素和美登普林等。

已发现几种放线菌可以表达安丝菌素，包括珍贵橙色束丝放线菌，主要产物为6种安丝菌素同系物，包括安丝菌素P-0、P-1、P-2、P-3、P-3'、P-4、P-4’，结构如下式所示：

主要区别为C-3位羟基上酯基的不同，通常作为前体化合物用于合成其他美登木素化合物，如美登素1（DM1）。美登木素类化合物因其强细胞毒性而在肿瘤治疗领域受到极大关注，但是因为强烈的毒副作用临床失败。目前临床上通过交联技术将美登木素生物碱（maytansinoids）与抗体交联靶向治疗取得了积极的疗效和较低的毒副作用。美登木素类物质在植物中的含量极低，植物提取的效率低、成本高；美登素的结构复杂，全合成的收率低、成本高，不具备实际应用价值；因此需要通过生物发酵分离其前体化合物，再进一步合成美登木素。安丝菌素P-2、P-3通常是所有安丝菌素中表达较高的，安丝菌素P-3结构稳定、疏水性强易于萃取，是合成美登素的最佳前体，安丝菌素P-3的选择性高表达有利于降低美登素的制备成本，同时减少杂质的产生，利用药品制备。

通过珍贵橙色束丝放线菌(CPCC260982、ATCC31281，属名:Actinosynnema,)制备安丝菌素的工艺已经有研究。美国专利US4331598和US4450234中，珍贵橙色束丝放线菌发酵产生的安丝菌素主要是AP-1、AP-2、AP-3、AP-3′、AP-4和AP-4'，都可以通过化学转变成美登木素生物碱，用于医疗用途。通常珍贵橙色束丝放线菌表达的安丝菌素总量一般在10-50mg/L，AP-3一般占比不到50%。且由于表达物为多种安丝菌素混合物，还有不少不希望产生的安丝菌素，如N-脱甲基、20-O-脱甲基以及19-脱氯处被修饰的产物，在还原性脱酰作用下这些安丝菌素不会变成美登木醇。不利于将来进行化学改造成美登木生物碱。

安丝菌素的总产量一般在10-50mg/L范围，产量低、生产成本高，且为多种安丝菌素同系物的混合物，不易分离。典型地，通过多步骤工艺回收并提纯安丝菌素，如AP-3，往往需要经过有机物萃取、重结晶、硅胶/氧化铝层析和析晶进一步提纯获得。

安丝菌素分离纯化工艺繁琐且涉及诸多的有毒的有机溶剂步骤，进行大规模的生产非常困难，且成本较高，因此提高最终目标物，安丝菌素，特别是主要产物AP-3的表达量，具有十分重要的经济意义。寻找高表达的菌株或通过发酵工艺改进提高安丝菌素的总表达量以及单一安丝菌素的占比对于安丝菌素的生产具有重要现实意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种珍贵橙色束丝放线菌(CPCC260982)发酵产生安丝菌素的方法，该方法可以高表达安丝菌素P-3。

本发明的主要技术方案是，选用珍贵橙色束丝放线菌，通过合理的发酵培养基成分的配比、发酵温度、溶氧和pH的控制实现安丝菌素的高表达和单一成分安丝菌素P-3占比的提升，使安丝菌素P-3的表达量达到100mg/L以上，其中安丝菌素P-3占全部安丝菌素比例在70%以上。

本发明提供一种珍贵橙色束丝放线菌发酵产生安丝菌素P-3的方法，包括如下步骤：

用珍贵橙色束丝放线菌（CPCC260982）在液体发酵培养基中培养，液体发酵培养基中含有2-10%的碳源、1-5%的氮源和0.1-2%的短链脂肪醇；发酵过程的pH值为6.5-7.5；温度为26-30℃；溶氧控制20%以上；

所述的碳源选自葡萄糖、果糖、淀粉、蔗糖、麦芽糖、麦芽提取物或甘油中的一种或两种以上。

所述的氮源选自蛋白胨、牛肉汤、酵母提取物、KNO₃、大豆粉、大豆胨、玉米浆、棉籽饼粉或棉籽饼浸出粉中的一种或两种以上。

所述的短链脂肪醇选自正丙醇、异丙醇、正丁醇或异丁醇。

所述的在液体发酵培养基中培养，培养条件是静止、振荡、通气浸没等。为在大容量的发酵器中较好的培养珍贵橙色束丝放线菌并实现高产量，优选通气浸没培养。

pH值优选7.0；温度优选28度；溶氧优选控制30%以上。

发酵的典型时间为120h至360h。