[发明专利]一种基于硅胶基质的原生质体固定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种原生质体的固定化方法，特别涉及一种基于硅胶基质的原生质体固定方法。 

背景技术

植物原生质体是指去除细胞壁被质膜所包围的、具有生命力的细胞，其结构包括细胞膜、细胞质（包括各种细胞器、细胞骨架系统及胞基质）和细胞核等部分。虽然原生质体失去了细胞壁这一屏障，使其成为植物生理学、细胞生物学、体细胞遗传学和植物病毒研究等的理想材料，但由于失去细胞壁的保护，原生质体在清洗、分离、载体转染等操作中容易破裂，不稳定。固定化后，由于载体的保护作用，稳定性提高。固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和胞内产物的分泌。固定化后利于对单个原生质体的定位观察。 

通常使用的多聚甲醛、戊二醛等醛类固定剂，碳化二亚胺，二甲基乙酰胺等非醛类固定剂，以及丙酮及醇类固定剂，都不能维持细胞的活性。琼脂凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶包埋条件温和，不影响固定细胞的活性，但是强度差。海藻酸钙凝胶由于其具有强度较好、价格低廉、无毒易操作等优点而广泛应用，但仍然由于其机械性不够，不能很好的起到保护包埋细胞的作用。硅胶具有反应条件温和、生物相容性好、热稳定性好、机械强度高、孔径可控及多样性的优点，是细胞固定的热门材料。但是单一使用硅胶，在合成无机基质的过程中，细胞暴露在非天然的环境中，甚至包埋细胞与凝胶的硅醇基结合，会使细胞生物活性降低。同时也由于空间限制，不利于细胞分裂，而使用大孔径支架方法会导致污染物进入。 

发明内容

本发明的目的是提供一种原生质体固定化方法。 

本发明所提供的原生质体固定化方法，可包括如下步骤： 

（1）将原生质体进行海藻酸钙包埋，得到包被有所述原生质体的海藻酸钙珠； 

（2）利用硅胶基质通过硅胶溶胶-凝胶法将步骤（1）所得的海藻酸钙珠进行包埋，得到包埋后的硅胶凝胶； 

（3）将步骤（2）所得的硅胶凝胶置于可溶性柠檬酸盐溶液中，溶解所述硅胶凝胶中的海藻酸钙成分，得到硅胶包埋的原生质体。 

上述方法步骤（2）中所述硅胶基质的制备方法为如下（a）或（b）： 

（a）以硅酸酯为前体的二步水解法：将硅酸酯在盐酸催化下水解，真空旋转蒸发除去水解产生的醇和部分水后，再和W1溶液以体积比1：2混合，加入甘油作致孔剂， SiO₂最终浓度为1.3M，使用前加氢氧化钠或Tris缓冲溶液调pH至6～7，得到所述硅胶基质； 

（b）酸化硅酸钠水溶液法：为了得到介孔（孔径在2到50纳米之间称为介孔）硅胶，将二氧化硅含量为0.41：2.6的硅酸钠水溶液和胶体二氧化硅水溶液等体积混合，用盐酸调节混合溶液pH至6～7，得到硅胶基质； 

所述W1溶液的溶质为甘露醇、2-吗啉乙磺酸和KCl，溶剂为水，所述甘露醇在所述W1溶液的终浓度为0.4~0.5M，如0.5M，所述2-吗啉乙磺酸在所述W1溶液的终浓度为4mM，所述KCl在所述W1溶液的终浓度为20mM。所述胶体二氧化硅水溶液是直径为1～5nm的二氧化硅粒子分散在水中所形成的溶液。 

在本发明中，所述硅酸酯可为硅酸四甲酯（Tetramethyl orthosilicate）或硅酸四乙酯（Tetraethyl orthosilicate）。在本发明的一个实施例中，所述硅酸钠为商品化的硅酸钠溶液，其中以SiO₂计的浓度为4.5M；所述二氧化硅为商品化的胶体二氧化硅 HS-40，其中SiO₂的浓度为6.7M。所述硅酸钠和所述二氧化硅在使用前均先用二次去离子灭菌水稀释，稀释后所得硅酸钠溶液中SiO₂的浓度为0.41M，稀释后所得胶体二氧化硅（所述胶体二氧化硅中二氧化硅粒子的直径为1～5nm）溶液中SiO₂的浓度为2.6M。 

在本发明的一个实施例中，调节所述混合溶液的pH值所采用的盐酸的浓度具体为3.0M，在实际操作中，也可大于3.0M，以减少酸溶液对所调节溶液的稀释。 

在本发明的一个实施例中，所得硅胶基质的孔径大小为10-50nm。 

所述柠檬酸盐溶液以W1溶液为溶剂，所述柠檬酸盐在所述柠檬酸盐溶液中的终浓度为1%～2%（1-2.0g/100ml）。在本发明的一个实施例中，所述柠檬酸盐具体为柠檬酸钾。 

在上述方法中，所述溶解去除所述凝胶珠中的海藻酸钙成分中，溶解时间可为45-90分钟，在本发明的一个实施例中，具体为60分钟。