[发明专利]一株生物合成3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮的菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株赤霉菌（Gibberella intermedia）CA3-1及其转化去氢表雄酮为3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮的方法。 

背景技术

优思明是一款由雌激素与孕激素复合而成的复方短效口服避孕药，含有的主要成分屈螺酮可以有效对抗口服避孕药中雌激素所引起的发胖的问题。3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮则是生产屈螺酮的重要医药中间体，其生产方式主要有传统的化学合成法、半合成法、生物转化法三类。生物转化法一般通过微生物转化羟化去氢表雄酮（DHEA）生成3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮，相比于化学方法减少了合成步骤、降低了能耗，并大幅削减了污染物的排放，属于先进的清洁生产工艺路线。 

  目前，据报道有刺盘胞属（Colletotrichum）、镰刀菌属（Fusarium）、支顶孢属（Acremonium）以及黑孢子菌属（Nigrospora）有7α和15α羟化能力，能将去氢表雄酮转化为3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮，但是普遍转化率不高，只有40~70%，且底物投料浓度较低，一般为1~5g/L，工业成本较高。因此，自主筛选出一株能高效转化DHEA生成3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮有很高的工业价值。 

发明内容

本发明的目的在于提供一株高效转化DHEA的赤霉菌（Gibberella intermedia）CA3-1，以及利用该菌株转化DHEA为3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮的方法，可达到高底物投料浓度、高产物得率的要求，并且菌种生长周期也较短。 

本发明的发明人从本实验室的菌种保藏库筛选获得一株赤霉菌（Gibberella intermedia）CA3-1，该菌于2011年5月24日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4903。 

应用上述微生物转化DHEA生产3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮的方法，其步骤如下： 

（1）采用保藏号为CGMCC No.4903的赤霉菌（Gibberella intermedia）CA3-1为生产菌种，按照常规方法进行活化培养得到种子液，将该种子液划线于PDA培养基上培养3~6天；

（2）制备CA3-1菌株的种子液：挑取步骤（1）的PDA固体培养基上的CA3-1菌株一环，接种于已灭菌的装有80~100mL种子培养基的500 mL锥形瓶中，培养温度为25~35℃，置摇床上以150~250 r/min的转速培养12~20h至对数生长中后期，即得到CA3-1菌株的种子培养液；

（3）菌体培养：将步骤（2）中制备好的细胞液体培养物以4~8%（v/v）的接种量接入发酵培养基，装液量为250 mL锥形瓶中装20~60 mL发酵培养基，培养温度为25~32℃，在150~220 r/min的转速下培养20~24 h，得菌体培养液。

（4）生物转化：精确称取适量DHEA，投入步骤（3）中的菌体液，使其终浓度为5-8 g/L，在转化温度26~30℃，200~220 r/min的转速下转化36~60h，即得转化液。 

（5）产物检测：将步骤（4）的转化液等体积乙酸乙酯抽提3次，合并抽提液后于离心浓缩仪中离心至有白色晶体出现，乙腈复溶晶体并通过0.22 μm的有机膜过滤除杂，滤液利用高效液相色谱法分析DHEA和3β,7α,15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮的含量。HPLC条件为色谱仪：戴安 Ultimate 3000；色谱柱：C18柱；检测器：Ultimate 3000 variable wavelength detector；流动相： 乙腈：水=70:30；流速：0.5mL/min；进样量：10μL；柱温：30℃。