[发明专利]磁性壳聚糖微球固定化辣根过氧化物酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及酶工程开发应用领域及环境保护领域中将酶固定化后能重复使用的磁性壳聚糖微球固定化辣根过氧化物酶的制备方法。

背景技术

酚类化合物是一种原型质毒物，可通过与皮肤、粘膜的接触不经肝脏解毒直接进入血液循环，致使细胞破坏并失去活力；也可通过口腔侵入人体，造成细胞损伤。高浓度的酚液能使蛋白质凝固，并能继续向体内渗透，引起深部组织损伤，坏死乃至全身中毒。

酶处理技术具有反应条件温和、处理速率快等优点，在水处理领域日益受到关注。辣根过氧化物酶（HRP）是由一个糖蛋白和一个铁卟啉辅基缀合而成的酶，能够在过氧化氢存在时催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。19世纪80年代中期，Klibanov等人第一次利用辣根过氧化物酶处理氯酚和苯胺。张国平等人采用HRP处理五氯酚模拟的模拟废水进行催化聚合处理，结果表明HRP可有效除去氯酚。郑琦等人用辣根过氧化物酶处理邻苯二酚废水，结果表明辣根过氧化物酶能有效去除邻苯二酚；李勤等人采用人工配水实验，研究HRP处理含苯酚和氯酚的废水，结果表明在最佳条件下，苯酚的去除率可达99.5%，对氯苯酚的去除率可达95%。Dec等利用富含HRP酶的植物材料处理含酚废水，也取得很好的效果。

由于辣根过氧化物天然酶稳定性差、易失活、不能重复使用，并且反应后混入产物，纯化困难，限制了其在工业中的广泛应用。而将酶固定化后，稳定性大大提高，可重复使用，这样不仅降低了废水处理的成本，还避免了蛋白质的污染等问题。

壳聚糖是由甲壳素经脱乙酰氨基而得到的一种天然碱性氨基多糖，是一种生物相容性好、易生物降解、无毒、廉价易得的天然高分子生物材料，并且易于加工成膜、多孔微球、凝胶等多种形态，使其成为国内外固定化酶载体的最受欢迎的高分子材料。如Chiou SH研究以壳聚糖固定化假丝酵母玫瑰酶，结果表明：改性后的壳聚糖微球具有很高的负载量，同时也保持了很高的酶活性；Krastanov A利用壳聚糖将Serratia plymuthica 细胞固定起来，用来催化蔗糖转化为异麦芽糖，其单位生产率达到0.76-1.15kg蔗糖/小时。然而以壳聚糖作为载体，液体流动性不好，难于进行长时间的连续操作；壳聚糖微球作固定化酶载体亦不利于固定化酶的快速分离和重复利用。故寻求其他方法改善壳聚糖的使用效果变得相对迫切。Wang W用环氧氯丙烷通过悬浮聚合的方式合成和活化磁性羟基壳聚糖微球，研究了交联剂用量对固定化酶和其活性的影响，结果表明，固定化酶的活性是游离酶的1.0834倍，确定了固定化酶对青霉素G的水解的最适pH值和最适温度，还发现其使用80次后，固定化酶还残留有大约94.2%的活性，且固定化酶的分离更加容易。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种具有磁响应性的磁性壳聚糖微球用于固定化辣根过氧化物酶。特提供一种磁性壳聚糖微球固定化辣根过氧化物酶的制备方法。

为达到以上目的，本发明采用以下技术方案：以聚乙二醇作表面活性剂和稳定剂，采用化学共沉淀-超声分散法制备具有良好生物相容性、稳定性、强磁响应性的纳米尺度的水基磁流体作为磁响应性物质；以水基磁纳米粒子作为磁响应物质，以壳聚糖作为载体，应用改良的乳化—化学交联技术制备磁响应性好、成球形好的磁性壳聚糖微球；以磁性壳聚糖微球作为载体， 用吸附-交联法制备磁性壳聚糖固定化辣根过氧化物酶。

一种磁性壳聚糖微球固定化辣根过氧化物酶的制备方法，其具体步骤是：

步骤（一）制备水基磁流体：将5g的聚乙二醇4000溶于100ml蒸馏水中，按质量比为1：4加入FeSO₄·7H₂O 2.78g和Fe₂（SO₄）₃·9H₂O 11.12g盐充分溶解，在搅拌和50℃保温的条件下，滴加浓氨水至pH≥10，再继续熟化反应1~2h后用质量百分比浓度为25%乙酸中和至pH=7.0，磁场分离，倾倒上层液体和浮渣后，用蒸馏水洗涤除杂质，即得到乌黑发亮的水基磁流体。