[发明专利]基于磷光发光技术的时间分辨荧光生物传感器及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于磷光发光技术的时间分辨荧光生物传感器及其应用，属于免疫检测技术领域。

背景技术

为解决FIA受来自样品，特别是生物样品较强且变化大的荧光背景，以及散射等因素的干扰问题，极大地促进了长寿命、长波长荧光标记层析试纸条(如镧系金属螯合物、卟啉类化合物)的合成和时间分辨荧光技术的发展，目前非同位素标记分析的灵敏度已达到或超过放射免疫分析方法。磷光分析法是荧光分析法的姊妹技术，相对于荧光，它又有其很多独特的优越性：(1)有大的Stokes位移，磷光的波长比荧光的波长长，和激发光谱离得较远，不会和激发光谱重叠，不仅可减少或消除试样(特别是生物试样)本底荧光和入射激发光的干扰，自吸收现象也有减轻；(2)由于T₁→S₀自旋禁阻，磷光的寿命比荧光长，磷光的寿命约为10^-3～10s，易于实现时间分辨测定；(3)选择性更好。但到目前，磷光免疫分析并未得到应有的发展。究其原因，主要受到磷光发光材料的限制，尤其是水溶性高、生物相容性好的磷光发光材料的缺乏，故未开发一种既适合于免疫分析，又能显示磷光检测优势的磷光技术。

金属卟啉是自然界中广泛存在的一类大环化合物，如血红素、叶绿素、VB12等，它们在生命体的新陈代谢以及很多基本生物过程中都起着不可忽视的作用。卟啉分子由四个吡咯环通过次甲基连结，形成一四配位卟啉核。卟啉环非常稳定，可与直径为3.7埃的金属发生配位；它与过渡态金属形成的络合物尤其稳定，比如，Zn-四苯基卟啉(ZnTPP)，其稳定常数为10²⁹。大部分金属都与卟啉形成1∶1的络合物，只有Na、K、Li络合物的配合比为2∶1，两个金属原子分别位于卟啉环平面的上方和下方。如图1所示，描述了卟啉能量跃迁产生磷光的原理。卟啉的电子吸收光谱主要有Soret带(又称B带)和Q带。Soret带位于400～450nm之间，摩尔吸光系数高(2～5×10⁵mol^-1.L.cm^-1)。而金属卟啉的Soret带吸收较弱，当环侧有亲电子基团时，Soret带将向长波方向移动。卟啉的Q带一般在450～650nm之间，有四个相关峰；当吡咯环氮上的氢被金属离子取代形成金属卟啉后，四个相关峰减弱或消失。卟啉和金属卟啉由于具有18电子大π离域结构，所以，以其B带或Q带作为激发波长，均在600～700nm间(或更长的波长范围)有不同程度的荧光发射；一般情况下，金属卟啉的荧光强度要弱于卟啉。室温下，卟啉本身不发磷光，当与某些金属形成络合物并与有序介质(如表面活性剂、蛋白质和核酸等生物大分子)共存时才在近红外区发射磷光；但只有极少数的金属卟啉发磷光，最常见的为钯卟啉和铂卟啉。钯/铂卟啉具有极强的磷光，其特点是长寿命(ms)，长波长(600～1000nm)。最常见的有水溶性meso-四(4-磺酸苯基)卟啉(H₂TSPP^4-)和meso-四(4-N-三甲氨基苯基)卟啉(H₂TMAP⁴⁺)的钯/铂络合物，以及非水溶性的八乙基卟啉(OEP)和四苯基-四苯并卟啉(Ph₄TBP)的钯/铂络合物等。600～1000nm的近红外区是研究生物物质发光探针和光化学传感器的一个极为有用的区域。所以，具有特殊磷光特性的钯/铂卟啉便成为生物分析方面非常有效的探针分子，结合一些简单的检测仪器便可提供很高的灵敏度和选择性。

如附图4所示，在外界激发下，铂卟啉在650nm发出强磷光，持续时间100微秒(吸收波范围390-410nm)，钯卟啉在670nm发出强磷光持续时间500微秒(吸收波范围400-420nm)。这些卟啉粒子也有很大的Stokes位移(均为280nm)。与其它发光材料相比较，铂/钯卟啉的优势在于极微的光漂白，使用便宜的强光源，如发光二极管就能有效激发。此外，生物样本和硝酸纤维素膜的背景荧光在390-420nm激发比在以铕离子为代表的时间分辨荧光的激发光波长365nm时都低。尽管390-420nm光透过硝酸纤维素膜也不尽理想，但优于365nm光，更适合于透射式测量。铂卟啉还可共价标记抗体，为检测各种样本提供了一个灵敏的快速检测技术。