[发明专利]一种高产丁醇的重组菌株及其构建方法

说明书

技术领域：

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种高产丁醇的重组菌株及其构建方法。

背景技术：

丁醇是一种重要的化工原料，主要用于增塑剂、溶剂、萃取剂等。近年来发现丁醇的热值、辛烷值与汽油相当，且能与汽油以任意比混合，可以使用现有的石油管道运输方式，丁醇已成为被世界各国企业和研究机构强烈关注的一种极具潜力的新型生物燃料。

丁醇主要有发酵和石油化工合成的方法生产。发酵法是粮食或其它淀粉质农副产品，经水解得到发酵液，然后在丙酮、丁醇梭菌作用下，经发酵制得丙酮、丁醇和乙醇的混合物，通常的比例为3：6：1，再经精馏得到相应产品。80年代起石油化工业的迅猛发展，发酵法无法与以丙烯为原料的羰基合成法竞争，因此很少采用该方法生产丁醇产品。但是，近年来由于石油价格的飞速上涨，加之石油资源的日益紧缺，导致原油价格的持续上涨，通过石油化工方法生产丁醇、丙酮的成本大大提高，发酵法生产丙酮、丁醇的技术重新显示出其优势，特别是发酵法生产丙酮丁醇是以可再生资源替代不可再生的石油基原料制造，符合国家能源安全的长远战略。与化学合成法相比，发酵法具有以下优势：

1)化工合成法以石油为原料，投资大，技术设备要求高；而微生物发酵法一般以淀粉质、纸浆废液、糖蜜和木质纤维素等为原料，其工艺设备与酒精生产相似，原料价廉，来源广泛，设备投资较小；

2)发酵法生产条件温和，一般常温操作，不需贵重金属催化剂；

3)选择性好、安全性高、副产物少，易于分离纯化；

4)降低了对有限石油资源的消耗和依赖。

但目前，丁醇发酵缺乏经济竞争力，其主要原因是：1）用作发酵的碳源成本偏高；2）发酵液中的丁醇浓度低；3）发酵过程中的丁醇选择性不高。为了解决上述问题，使发酵法在经济上具有较好的竞争能力，自上世纪六十年代以来，世界各国研究工作者在菌种改造、发酵原料、代谢途径、产物分离等方面进行了大量研究，我国工作者也对丙酮丁醇发酵进行了一系列探索。

发明内容：

本发明的目的是提供一种高产丁醇的重组菌株及其构建方法。

本发明将丁醇产生菌的丁醇生物合成途径的酶的基因克隆进入丙酮丁醇梭菌中，使丁醇生物合成途径的酶过量表达，以提高丁醇的产量，从而实现了本发明的目的。

本发明的高产丁醇的重组菌株是通过以下方法构建的，包括以下步骤：

将目的片段与表达载体相连得到重组表达质粒，然后将重组表达质粒转化进入丙酮丁醇梭菌中，从而得到高产丁醇的重组菌株；

所述的目的片段为表达盒EC或丁醇脱氢酶基因bdh；或表达盒EC、丁醇脱氢酶基因bdh和操纵子Sol中两者或三者的结合；

所述的表达盒EC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

所述的操纵子Sol，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；

所述的丁醇脱氢酶基因bdh，其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。

所述的表达盒EC具体是将氯霉素启动子Pcm、β-羟丁酰-CoA脱氢酶基因hbd（其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示）、乙酰-CoA乙酰基转移酶(硫解酶)基因thl的自身启动子Pthl、乙酰-CoA乙酰基转移酶(硫解酶)基因thl（其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示）、β-羟丁酰-CoA脱水酶（巴豆酸酶）基因crt的自身启动子Pcrt、β-羟丁酰-CoA脱水酶（巴豆酸酶）基因crt（其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示）、丁酰-CoA脱氢酶基因bcd（其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示）顺序相连，得到表达盒EC。

所述的操纵子Sol具体是将操纵子Sol启动子Psol1、Psol2、醇脱氢酶基因adhE（其编码蛋白的序列如SEQ ID NO.17所示）、酰基-CoA转移酶基因ctfA（其编码蛋白的序列如SEQ ID NO.18所示）、ctfB（其编码蛋白的序列如SEQ ID NO.19所示）顺序连接，得到操纵子Sol。