[发明专利]Rosea 1和Delila作为筛选标记在菊花转基因育种中的应用

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种菊花可视标记基因Rosea 1和Delila在菊花转基因育种中的应用。 

背景技术

菊花是我国的传统名花，具有重要的观赏价值和经济价值。目前转基因工程技术由于其巨大的优越性，正成为观赏植物育种的重要手段。但是在遗传转化过程中，使用的标记基因会产生潜在的生态环境和食品安全性问题，因此使用安全标记基因或去除选择标记已成为基因工程育种的重要目标和发展趋势。 

标记基因的安全性问题是近年来国际上关注的热点，截止目前解决转基因植物安全性的主要策略有两种：1、开发使用无争议的生物安全标记基因或对抗性基因标记进行一定修饰；2、在转化时仍使用传统的抗性标记基因，但获得转基因植株后再将其去除。 

目前，利用无争议的生物安全标记基因是提高标记基因的安全性最为有效的办法，是基因工程发展的必然趋势（王永飞，2004）。与常规标记基因相比，生物安全标记基因没有抗生素或除草剂抗性，相对来说对生物是安全的，目前有应用前景的安全标记基因可以分成两大类：负向选择系统和正选择系统，主要包括化合物解毒酶基因、糖类代谢酶基因、激素代谢酶基因、报告基因等。 

去除转基因植物中标记基因的方法主要有共转化法、位点特异重组酶系统、转座子法、多元自主转化载体系统和同源重组等方法。 

花青素可视标记基因属于生物安全标记基因。花青素代谢调节基因导入植物细胞之后,细胞可能变成红色,无需进行组织化学测试而杀死植物组织，用一般的解剖镜甚至肉眼即可观测，在众多的植物遗传 转化报告基因中是最方便的一种。目前,这些基因已被广泛应用到单子叶植物遗传转化条件的优化上。单立波等（2009）研究了玉米花色素苷合成调节基因C1-R在小麦幼胚、玉米愈伤组织、水稻愈伤组织、烟草叶片中的瞬时表达情况。由于调节基因C1-R激活了植物体细胞内花色素苷的合成，因此不需任何生色底物，即可活体观察到花素苷的表达。结果表明，对于小麦、水稻、玉米，枪击48小时后，放大2倍便可见红色斑点，且其表达强度远高于GUS的表达，证明C1-R基因可以作为一个很好的衡量打枪效果的指示，同时还证明其在双子叶植物烟草叶片的基因枪转化瞬时表达体系中也起同样的作用。 

目前对于植物花青素的时空合成机制已有深入的研究，不同植物中的花青素生物合成受两类基因的控制:一类是结构基因，编码合成代谢中的酶类；另一类是调节基因，调节结构基因的表达强度和程式。 

在花青素合成途径中，调节基因影响着结构基因的表达方式和表达强度,每一步酶促反应均是调节基因作用的靶位点。目前植物中已分离和鉴定了3类花青素合成的转录因子（Ramsay and Glover,2005）：（1）R2R3-MYB蛋白；（2）MYC家族的bHLH蛋白；（3）WD40蛋白。利用转座子标签等技术现已从金鱼草、玉米、矮牵牛、紫苏和拟南芥等多种植物中分离出相应的调节基因(刘仕芸等,2006)：如属于MYB型的玉米c1/pl基因，矮牵牛an2、an4基因，金鱼草rosea1/2、venosa基因；bHLH型的玉米r/b基因、in1基因，紫苏myc-rp/gp、mycf3g1基因，金鱼草Delila、mutabilis基因；WD40型的矮牵牛an11基因、紫苏pfwd基因、拟南芥ttg1等。研究表明，多数调节基因对花青素途径的调控是在结构基因转录水平上的调控，并且多数的调控是转录激活，只有少数几种调节基因为转录抑制调控。 

金鱼草中3个调控基因Delila、eluta和rosea主要对花青素合成途径的后阶段起调节作用,而对早期CHS和CHI阶段表现微量调控 (Martin et al.,1991)。 

随着转基因工程中抗生素标记基因带来的问题，目前研究安全标记基因成为人们解决这一问题的主要方法。因此寻求安全标记基因成为转基因工程的热点和难点。花青素可视标记的应用为安全转基因提供了一种新的方法。 

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供Rosea 1和Delila作为筛选标记在菊花转基因育种中的应用。 

本发明提供的Rosea 1和Delila作为筛选标记在菊花转基因育种中的应用，具体是将金鱼草的花青素调节基因Rosea 1和Delila共转化到菊花中，与未转化的对照相比，出现花青素积累或花青素积累量增加的即可初步判断为转基因阳性植株。