[发明专利]牛奶中土霉素残留ELISA检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及牛奶药物残留检测技术领域，具体是牛奶中土霉素残留ELISA检测方法。 

背景技术

兽药残留，即“兽药在动物源性食品中的残留”的简称，指的是动物产物中任何可食部分所含兽药的母体化合物及（或）其代谢物，以及与兽药相关的杂质的残留。近几年，我国畜产品开始进入国际市场，但由于药物残留超标而被贸易国家退货、销毁，甚至中断贸易往来，造成了极大的经济损失和影响。动物性食品中抗生素的严重残留是极为普遍的问题，已经对人类健康构成了潜在的危害，从而受到国内外的普遍关注。 

土霉素（Oxytetracycline，OTC）是20世纪40年代发现的四环素族成员，别名地霉素、5-羟基四环素、地灵霉素、氧四环素等，为广谱抗生素，对革兰氏阴性菌和阳性菌、立克次氏体等均有抑菌作用，主要是通过阻止氨酰tRNA与细菌30S核糖体的末端结合来抑制细菌蛋白质合成。在临床应用上土霉素被广泛用于治疗奶牛乳房炎、子宫内膜炎，并常常被用作饲料药物添加剂，用于防治肠道感染和促进畜禽生长。 

土霉素具有免疫抑制影响，当长期摄入含有低剂量残留土霉素的牛奶或奶制品，土霉素在人体内不断地蓄积，当其浓度达到一定剂量时，能导致人体各种器官（胃、肠、肝脏）或组织的病变。土霉素易与人体内的钙结合，易在骨骼和牙齿中沉积，导致骨质疏松，牙齿发育不良等，最明显的残留毒性是诱导产生耐药菌株。 

依据我国食品质量安全的规定，土霉素残留是畜产品的必检项目之一。常见的土霉素残留检测方法主要是微生物检测法、仪器分析检测法和免疫检测法，其中微生物检测法不易筛选到特别专一敏感的菌株，易受到其他抗菌药物的影响。近年来随着高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）以及LC-MS等联用技术的飞速发展，仪器分析检测法很大程度上提高了分析的灵敏度和分辨率，拓宽了药物残留分析范围，但这种技术一般需要昂贵的仪器设备、大量复杂的前处理、较长的分析周期和对技术人员的技术水平有较高要求等，限制了其使用范围，不适合大量样品的快速检测和对药物残留的及时监控。而免疫检测法具有检测成本低，检测时间短，操作程序简便且可以同时检测多个样品，特异性高等特点，酶联免疫吸附测定法正逐渐广泛应用于药物的残留检测。 

发明内容

本发明的目的是提供一种牛奶中土霉素残留ELISA检测方法，该方法采用酶联免疫吸附检测试剂盒，具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度，操作方法简单，能够批量、快速检测牛奶中土霉素的残留。 

本发明所提供的牛奶中土霉素残留ELISA检测方法，通过以下步骤实现： 

（1）土霉素免疫原和包被抗原的合成、鉴定

采用重氮法将土霉素标准品通过同型双功能团试剂（O-tolidine）与牛血清白蛋白（BSA）偶联得到免疫原（OTC-tolidine-BSA）；再用相同方法将土霉素标准品通过同型双功能团试剂（O-tolidine）与卵清蛋白（OVA）偶联得到包被抗原（OTC-tolidine-OVA）；将BSA、OVA、OTC、O-tolidine和偶联产物，于波长190～400nm下进行紫外扫描鉴定；同时也对合成免疫原以及载体蛋白BSA做SDS-PAGE电泳实验进行鉴定；

（2）单克隆抗体的制备

取50～100μg 步骤（1）所得的免疫原与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化，常规免疫方法免疫Balb/C小鼠，取出抗血清效价4000以上的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合，具体操作依 ClonaCellTM-HY Hybridoma Cloning Kit说明进行；经ELISA法筛选及有限稀释法亚克隆化，建立能稳定分泌抗OTC的杂交瘤细胞株，获得抗OTC单克隆抗体；

（3）OTC间接竞争性ELISA检测

1）包被抗原：①每孔加100μL1000×稀释的包被抗原OTC-OVA； 

②37℃孵育2h，后洗涤液洗涤2次，扣干；

2）封    闭：③每孔加入150μL的封闭液；

④37℃孵育2h，后洗涤液洗涤3次，扣干；

3）加    样：⑤每孔加入50μL待测样品，50μL1万×稀释的单抗；

⑥37℃孵育30min，后洗涤液洗涤5次，扣干；

4）酶标二抗：⑦每孔加入100μL5000×稀释的羊抗鼠IgG：HRP酶标二抗；

⑧37℃孵育30min，后洗涤液洗涤5次，扣干；

5）显色反应：⑨每孔加入100μL底物反应液，37℃避光反应20min；