[发明专利]一种玉米农华101种子纯度检测方法

说明书

技术领域

本发明属于种子质量检测领域，具体涉及一种玉米农华101种子纯度检测方法。

背景技术

聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis)，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应，用于分离蛋白质和寡糖核苷酸。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。

从玉米种子中提取的蛋白质在凝胶的分子筛效应、样品的浓缩效应和电泳分离的电荷效应下得到良好的分离，通过显色显示蛋白质谱带类型。不同品种因遗传基础不同，因而形成的蛋白质种类和数量不同，电泳分离后所形成的蛋白质谱带类型也不同，并可作为品种指纹(Fingerprint)，即鉴定品种的生化性状，利用品种指纹来分析单粒种子鉴定品种纯度。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种玉米农华101种子纯度检测方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)种子蛋白质提取：取单粒种子粉碎后，加入0.6-0.8ml蛋白提取液，摇匀，盖好后在室温放置20-40min，加样前4000-8000rpm离心10-20min；

2)取步骤1)离心后的上清，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；

3)电泳后将胶板进行染色，按农华101的标准谱带鉴别出异品种种子粒数，计算品种纯度，

其中，所述的蛋白提取液为含有质量分数为15-20％和体积分数为15-20％的冰醋酸的水溶液。

其中，聚丙烯酰胺凝胶电泳的电极缓冲液为含有体积分数为0.3-0.5％冰醋酸和质量分数为0.03-0.05％甘氨酸的水溶液。

其中，聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶按如下方式制备：

1)制备制胶液：

1号：90g丙烯酰胺+3g甲叉双丙烯酰胺加水溶解并定容至500ml；

2号：60g脲加水溶解并定容至200ml；

3号：48ml 1M氢氧化钾+17.2ml冰乙酸加无离子水溶解并定容至100ml；

5号：四甲基乙二胺的原液；

6号：10g过硫酸铵加水溶解并定容至100ml；

2)灌分离胶：

依次取1号22.5ml、2号5ml、3号3.75ml、6号1.6ml、5号0.2ml混合摇匀后，灌入胶室至距顶端2-3cm为止，避免形成气泡，胶聚合后，用滤纸或注射器吸去析出的水。

其中，聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶按如下方式制备：

1)制备制胶液：

1号：90g丙烯酰胺+3g甲叉双丙烯酰胺加水溶解并定容至500ml；

2号：60g脲加水溶解并定容至200ml；

4号：48ml 1M氢氧化钾+2.9ml冰乙酸加水溶解并定容至100ml。

5号：四甲基乙二胺的原液；

6号：10g过硫酸铵加水溶解并定容至100ml；

2)灌浓缩胶：

依次取1号3ml、2号2ml、4号5ml、6号0.3ml、5号0.04ml迅速摇匀后灌入分离胶上面，并立即插入样品梳，待浓缩胶聚合后拔出样品梳，用吸去各凹槽中多余的水分。

其中，聚丙烯酰胺凝胶电泳中，每个样品加样25-30μl。

本发明具有以下有益效果：

1)快速、简便

农华101传统纯度检测方法为SSR检测，该方法样品采用人工挖胚，还要进行多对引物筛选，从提取到电泳染色操作全过程复杂繁琐，一个工作日(按8小时计算)至多能够完成7个样品的纯度检验。而本发明方法样品使用单粒样品粉碎进行研磨，采用比例药剂配方，提取至电泳染色步骤简单，可轻松出具12个样品的纯度结果，检验速度几乎翻倍。

2)电泳谱带清晰、可长期保存

采用SSR标记的检测需在紫外凝胶成像系统中观测，清晰度很难调节，只能获得电泳图片，胶片无法保存，而且胶片中残留EB，毒性大，不利环保。而本方法电泳谱带在胶片上即可清晰显现，无剧毒，易于观测将其装去自封袋放入冰箱或放入水中加几滴醋酸都可长期保存。

3)节约成本

经计算，本发明方法所需仪器设备价格不到SSR检测的1/10，所用药品价钱也很便宜，检验相同样品量成本至少降低一半左右。

总之，本发明方法是对玉米杂交种农华101纯度检验的一项技术性突破，适应范围广，节约效果显著，有很好的应用推广价值。

附图说明