[发明专利]适用于大规模基因型鉴定的牛奶中基因组DNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别是涉及一种适用于大规模基因型鉴定的牛奶中基因组DNA的提取方法，该方法能够从10mL-13mL鲜奶中提取质量完整、浓度及纯度较好的基因组DNA，以该DNA为模板进行PCR扩增，可以扩增出1000bp以上的长片段牛基因组DNA序列，进而开展基因型鉴定和分子生物学分析。

背景技术

近几年来，分子生物学技术已成为奶产品质量检测和分子营养研究中的有利工具。获得高质量基因组DNA是进行食品营养功能鉴定、食品可溯性、奶牛群体遗传变异、分子标记辅助选择育种、亲子鉴定、DNA Southern杂交等后续分子生物学研究的基础。目前，分离奶牛DNA的材料主要包括血液、肌肉组织、脏器组织等，血液的收集主要采用奶牛颈静脉采血，组织的收集采用剪耳法。生产实践中发现，这些方式都会对奶牛产生应激，影响奶牛生产水平，也有一定的技术难度，需要专业人员进行操作，而且对于奶牛场来说也是一笔不小的损失，采样阻力很大。因此，寻求更为适宜的材料势在必行。

牛奶中的体细胞通常由多形核嗜中性白细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和少量的乳腺组织上皮细胞等组成。在正常生理状况下，每毫升牛奶约有2万-20万个体细胞。体细胞数受年龄和胎次、泌乳期阶段、季节、机体应激、个体特性以及挤奶操作等因素的影响。奶牛具有独特的防御体系，当奶牛的泌乳系统受不同种类细菌的侵袭而发生感染及损伤时，通过机体的免疫机制承担排除感染与修复受破坏组织任务的白细胞就会在此集聚。随之该乳腺组织分泌的乳汁中体细胞数即大幅度上升至30万-1000万。血液中的细胞数也会随着感染度不同而不同，一般在700万-1000万范围内。在相同体积下，血液中最少体细胞个数约为牛奶中最少体细胞个数的350倍，因此从牛奶中提取DNA相对困难一些。经前人研究显示，平均每毫升牛奶的体细胞数达到30万左右，即基本达到了提取DNA的细胞浓度，从牛奶中提取DNA理论上是可行的。

近年来，一些国内外少数研究者开始探究从牛奶中提取基因组DNA的方法，田雨等将分离牛奶体细胞技术与高温裂解法结合提取DNA，张军伟等进行了该方法的优化，Murphy等也运用苯酚/氯仿法提取出了DNA。但是，这些方法取样量较大，都在50mL以上；而且提取的DNA只能进行500bp以内的小片段基因序列的PCR扩增，不适合大规模基因型的鉴定以及分子生物学分析。

综上所述，优化建立适于大规模基因型鉴定的一种新型、简便的基因组DNA提取方法，是申请人研究的课题之一。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种适用于大规模基因型鉴定的牛奶中基因组DNA的提取方法，该方法能够在10mL-13mL鲜奶中提取质量完整、浓度及纯度较好的基因组DNA，以该DNA为模板进行PCR扩增，可以扩增出1000bp以上的长片段牛基因组DNA序列，进而开展基因型鉴定和分子生物学分析。

为了实现上述任务，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种适用于大规模基因型鉴定的牛奶中基因组DNA的提取方法，其特征在于，该方法按如下步骤进行：

步骤一，离心管准备：选购15mL离心管，在高压灭菌锅中进行灭菌，备用。

步骤二、牛奶采集：采集新鲜牛奶10mL-13mL至离心管中，每个管中加入2滴重铬酸钾，冰袋带回，放置-20℃保存。

步骤三，牛奶体细胞分离与富集：将上述低温保存的奶样于4℃解冻，在2500r/min，4℃下离心30min。用小勺刮去离心管上层的乳脂，用吸管将中间层的乳蛋白去掉，留下最底部的的沉淀层。向离心管底部加入600μL磷酸缓冲液（PBS），将底部沉淀捶打悬浮并转移至1.5mL的离心管中，3500r/min常温离心10min，弃去上层液体，保留底部沉淀。再向底部沉淀加乳化剂60μL、PBS 540μL，用振荡器振荡至沉淀完全悬浮，40℃恒温水浴处理10min脱去体细胞周围的乳脂，3500r/min，常温离心10min，弃上清，加PBS 500μL悬浮沉淀，于12000r/min低温离心10min使体细胞沉淀富集，弃上清。

步骤四，牛奶体细胞消化：向体细胞沉淀中加入350μL的DNA提取缓冲液，50μL的SDS，10μL的蛋白酶K，在56℃下水浴消化过夜。