[发明专利]一种抗人神经丝中分子量亚单位单克隆抗体及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗人神经丝中分子量亚单位单克隆抗体及其制备方法与应用，以及分泌产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，属于生物工程技术领域。 

背景技术

神经丝（Neurofilament,NF）是存在于神经细胞胞体和轴突中的一种特化的中间丝，外径约为10nm的纤维状结构，由高分子量（NF-H）、中分子量（NF-M)以及低分子量（NF-L)三个亚单位组成，其在哺乳动物体内分子量分别约为200KD，160KD和68KD。NF的生理功能与神经细胞内的物质运输和维持轴突形态、直径和延伸有关。 

NF与多种原因引起的神经性疾病有关。脊髓侧索硬化征（ALS）、早老性痴呆（Alizheimers disease,AD）和帕金森综合征（Parkinson’s disease,PD）等疾病与NF有关；脑外伤和脑出血病人也引起NF变化；一些中毒性神经病如一氧化碳、铅、汞、正己烷、氯丙烯、二硫化碳、1-溴丙烷、有机磷等均可引起NF的改变。NF作为神经损伤的生物标志物，具有较好的特异性，且可从血清中检测到，而NF-M又是三个亚单位中检测神经损伤最为敏感的亚单位。因此，对NF-M进行定量检测，对神经系统损伤的诊断和观察预后具有十分重要的意义。 

神经丝中分子量亚单位的检测主要是免疫学方法，包括Western blot、免疫组织化学以及免疫荧光标记技术。这些技术不仅需要灵敏度高，特异性强的抗体，还需要人体组织标本，因此不方便检查诊断。目前国际上还没有NF-M检测试剂盒，国内尚没有抗NF-M抗体，更缺乏灵敏度高、特异性强的抗NF-M McAb。因此，制备抗人神经丝中分子量亚单位单克隆抗体，建立具有我国自主知识产权的灵敏度高、特异性强的血清中NF-M检测方法，提高临床诊断技术和治疗水平，有重要的使用价值。 

发明内容

针对上述现有技术，本发明利用人工合成的人神经丝中分子量亚单位多肽为半抗原，与匙孔槭血蓝蛋白（Keyhole limpet hemocyanin，KLH）偶联后免疫小鼠，用细胞融合的方法制备了1株分泌抗神经丝单克隆抗体的杂交瘤细胞2C1，其分泌产生的抗体灵敏度高，特异性强，与小鼠、大鼠NF有交叉反应，可用于人、大鼠和小鼠神经丝中分子量亚单位检测试剂盒的研制。 

本发明的技术方案如下： 

一种抗人神经丝中分子量亚单位单克隆抗体，该单克隆抗体对SEQ ID NO.1所示氨基酸 序列的多肽具有特异性，所述单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.6064的细胞株分泌产生。 

一株产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C1，命名为小鼠杂交瘤细胞，已于2012年04月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.6064。 

所述单克隆抗体在定量检测人、小鼠或大鼠神经丝中分子量单位中的应用。 

一种定量检测人、小鼠或大鼠神经丝中分子量单位的检测试剂盒，所述检测试剂盒中含有上述的单克隆抗体。 

本发明选择人的NF-M N端GNPSAYRRVTETRSSFSRVSGSPSSGFRSQSWSRGSP-C（SEQ ID NO.1所示）氨基酸序列进行人工合成。合成的多肽采用Sulfo-SMCC方法与KLH蛋白进行偶联，制备KLH-NF-M完全抗原，KLH-NF-M偶联抗原免疫Balb/c小鼠获得了较好的免疫应答。细胞融合后，经ELISA方法筛选，并用间接竞争ELISA方法确证，从中选择出分泌抗人NF-M McAb的细胞株，经3～4次亚克隆，达到3次100%阳性，建立了1株能稳定分泌抗NF-M单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为2C1，并对其进行了保藏。 

本发明的有益效果：本发明提供了一种抗人神经丝中分子量亚单位单克隆抗体，该抗体灵敏度高，特异性强，与小鼠、大鼠NF有交叉反应，可用于人、大鼠和小鼠神经丝中分子量亚单位检测试剂盒的研制。 

附图说明

一株产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C1，命名为小鼠杂交瘤细胞，已于2012年04月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.6064，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。 

图1为NF-M多肽间接竞争抑制ELISA曲线。 

图2为Western blot检测2C1与小鼠、大鼠和人血清中的NF-M的反应性。 

图3为免疫组化方法检测2C1与大鼠石蜡切片中NF-M的反应性。