[发明专利]一种检测新霉素残留的胶体金试纸条及其使用方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于兽药残留分析和免疫学技术领域，具体涉及一种检测新霉素残留的胶体金试纸条及其使用方法和应用。

背景技术

新霉素(Neomycin，NEO)是属于氨基糖苷类药物中的一种碱性抗生素。新霉素对第Ⅷ对脑神经具有损害作用，会造成不可逆性耳聋，并且有较强的肾脏毒性，亦可引起机体对维生素A及B₁₂吸收不良，导致维生素的缺乏而引起相关病症。新霉素在兽医临床和畜禽养殖上仍被广泛应用，尤其是不规范用药引起畜产品中的新霉素药物的残留，会对食品卫生、公共健康产生严重威胁。因此各国对动物性产品中新霉素的残留制定了严格的限量标准。

动物组织中新霉素残留的检测方法有微生物法，高效液相色谱法，薄层层析法，电泳法和酶联免疫分析法、免疫层析方法等。在动物性组织基于抗原抗体特异性反应建立起来的免疫层析方法具有样品预处理简单，分析时间短，使用方便等特点，在大规模筛选检测中有广阔的应用前景。目前，尚未见有新霉素免疫层析试纸条的文献和专利报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测新霉素残留的胶体金试纸条及其使用方法和应用。

本发明是基于一种能同时识别新霉素、阿米卡星和巴龙霉素的单克隆抗体（该单克隆抗体是由杂交瘤细胞EDC/5G04分泌的，杂交瘤细胞EDC/5G04由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO:C201144），通过制备胶体金，标记纯化后的抗体，优化各项层析条件等，制备了胶体金试纸条。针对新霉素具有溶于水，微溶或不溶于常见有机溶剂的特点，采用碱性缓冲液作为提取试剂，加热使蛋白质变性以减少基质的干扰等手段，建立了组织样品中新霉素的提取方法，进而完成本发明。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种胶体金试纸条，包括吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫依次粘贴在塑料衬板上，其特征在于所述金标垫包被有胶体金标记的能识别新霉素、阿米卡星和巴龙霉素的单克隆抗体，所述检测线包被有新霉素包被原，所述质控线包被有羊或兔抗鼠IgG。

所述的能识别新霉素、阿米卡星和巴龙霉素的单克隆抗体是由杂交瘤细胞EDC/5G04所分泌的，所述杂交瘤细胞EDC/5G04于2011年6月29日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏号为CCTCC NO:C201144。

所述的新霉素包被原是由新霉素（NEO）与卵清蛋白（OVA）形成的偶联物（NEO-OVA）。

所述的胶体金试纸条的使用方法，包括用样品提取液对组织样品前处理和用胶体金试纸条进行检测的步骤，所述样品提取液为pH10～11的磷酸盐缓冲液，其配制方法为：准确称取KH₂PO₄ 0.40g，NaCl 20.00g，Na₂HPO₄·12H₂O 13.40g，KCl 0.50，NaOH 0.32g，少量超纯水溶解，定容至500mL，所述前处理的方法为： 称取组织匀浆样品1g，加入10ml样品提取液，涡旋混匀，60℃孵育30分钟，冷却至室温并摇匀，以4000转/分钟的转速，室温离心10分钟，取上清液。

所述组织样品为牛奶、鸡肉，猪肉、虾肉、牛肉、羊肉、猪肝中的一种或多种。

所述的胶体金试纸条在新霉素残留检测中的应用。

具体步骤如下：

（1）复苏杂交瘤细胞EDC/5G04，免疫小鼠，制备单克隆抗体，并利用辛酸硫酸铵进行纯化。

（2）利用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，优化标记条件，制备胶体金标记的能识别新霉素、阿米卡星和巴龙霉素的单克隆抗体；

（3）将包被原NEO-OVA和羊或兔抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜上；

（4）将待测样品用缓冲液提取，利用试纸条检测。