[发明专利]一种生产高品质微藻生物柴油的方法

权利要求书

1.一种生产高品质微藻生物柴油的方法，其特征在于：

（1）种子培养

将装有普通小球藻Chlorella vulgaris的三角摇瓶接种至无菌光生物反应装置，在已灭好菌培养基中光照培养；光生物反应器系鼓泡式密闭反应器，包括CO₂储气瓶、混气装置和气体流量计；种子培养基及培养条件如下：海盐24-34g/L，CH₃COONa 0.3-0.5gL，NaNO₃200-300mg/L，NaH₂PO₄ 50-100mg/L，Na₂EDTA 10mg/L，FeSO₄·7H₂O2.5-5.0mg/L，Vitamin  B₁ 0.006-0.06mg/L，Vitamin B₂0.00005-0.0005mg/L，光源采用荧光灯或LED，光照强度为8-10Klux，光质为白光，初始pH为6.0-7.5，通气强度为0.2-0.7VVM，CO₂浓度为0-0.5%，培养温度为23-26℃，培养3-5天，直到对数期，收集种子准备下一阶段发酵；

（2）种子收集

细胞收集采用离心或气浮采集方法，离心采集方法是在转速为4000-12000rmp情况下，常温下离心1-10min，得到藻泥后，用清水清洗2-3次，再在同等条件下，离心得到的藻泥，然后，用少量的清水均匀重悬，即为后续发酵的种子；

（3）第一阶段发酵

将准备好的种子接到装有发酵培养基的光生物反应器中，该反应器为室内开放式系统，包括CO₂储气瓶、混气装置和气体流量计；该培养阶段的培养基及培养条件如下：海盐28-34g/L，NaNO₃350-550mg/L，NaH₂PO₄ 30-80mg/L，Na₂EDTA 10-30mg/L，FeSO₄·7H₂O 2.5-5.0mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.01mg/L，ZnSO4·7H₂O0.03-0.06mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.02-0.05mg/L，MnCl₂·4H₂O0.2-0.6mg/L，Na₂Mo₄·2H₂O 0.1-0.3mg/L，Vitamin B₁ 0.006-0.06mg/L， Vitamin B₂ 0.00005-0.0005mg/L，生物素0.00005-0.0005mg/L，其中氮磷元素之比为15-25最佳，光源采用荧光灯或LED灯，光照强度为8-10Klux，光质为白光或蓝光，初始pH为6.0-7.5，通气强度为0.4-0.7VVM，CO₂浓度为0.5-2.0%，培养温度为24-26℃，培养至氮营养浓度降到零时，改变培养条件，即发酵进入第二阶段；

（4）第二阶段发酵

通过增加灯光的数量或减小光源与光生物反应器之间的距离来增加光照，光质为白光或蓝光，光源采用LED灯或荧光灯，光照强度为30-70Klux，通气强度为0.4-0.7VVM，CO₂浓度为0.5-2.0%，培养温度为27-30℃，待藻液变为淡黄色或藻内叶绿素大幅下降时，发酵结束；

（5）微藻采收

采收采用离心、化学絮凝或气浮；

（6）油脂提取

采用先破碎后提取的办法，破碎采用酶法破碎、超声破碎或液氮破碎，油脂提取采用有机萃取法；采用氯仿/甲醇/水按（1：1：1）体积或乙醚/正己烷/水（1：1：1）体积常温萃取。

2.根据权利要求1所述的生产高品质微藻生物柴油的方法，其特征在于：接种密度在1.0×10⁷个/L。

3.根据权利要求1所述的生产高品质微藻生物柴油的方法，其特征在于：化学絮凝剂采用硫酸铁、氯化铁、硫酸铝、氯化铝或壳聚糖，将培养好的藻液收集在容器中，向容器中按藻液比例加20-80mg/L的絮凝剂，待絮凝完全，倾去上层水层，得到藻泥。

4.根据权利要求所述的生产高品质微藻生物柴油的方法，其特征在于：酶法破碎的酶选自纤维素酶、中心蛋白酶、碱性蛋白酶、果胶酶、破壁酶、蜗牛酶或脂肪酶。