[发明专利]CE-TOF/MS法测定人体血浆和尿中马钱子碱和士的宁含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及马钱子碱和士的宁含量的测定方法，具体涉一种CE-TOF/MS法测定人体血浆和尿中马钱子碱和士的宁含量的方法。

背景技术

马钱子又名番木鳖，始载于《本草纲目·卷十八》，是马钱科植物马钱Strychnos nux-vomicaL.或云南马钱Strychnos pierriana.A.W.Hill的干燥成熟种子，具有通络止痛、散结消肿之功效。药理学研究表明，马钱子具有中枢兴奋、镇痛镇静、抗菌消炎、抗肿瘤等药理作用。总生物碱为其有效部位，其中马钱子碱（brucine）和士的宁（strychnine）等吲哚类生物碱成分是其主要有效成分，士的宁占35%-50%，其次是马钱子碱。

马钱子碱在马钱子生物碱中是最具有开发前景的一种生物碱，不仅是药理活性明显高于马钱子碱氮氧化物、士的宁和异士的宁等其他马钱子中的生物碱，而且毒性相对比较低，口服中毒剂量为士的宁的71倍，注射为45倍。抗关节炎实验表明，士的宁没有治疗作用，但是马钱子碱却有着明显的治疗作用。目前马钱子碱在临床上已经制成了相关剂型的药物，已有马钱子碱脂质体、微乳等制剂的相关文献报道。

目前，体液及组织中马钱子碱和士的宁的检验方法有颜色反应、薄层色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用法和高效液相色谱法，其中以气相色谱和气-质联用法最为常见。但由于这两种生物碱的相对分子质量较大不易汽化，应用气相色谱法需采用较高的柱温，不仅保留时间长、灵敏度低，而且易造成柱流失。正相高效液相色谱法分离马钱子碱和士的宁由于实验成本较高、不具有普遍应用性，已很少使用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种CE-TOF/MS法测定马钱子碱和士的宁含量的方法，以盐酸小檗碱为内标，建立CE-TOF/MS法同时测定人体血浆和尿中马钱子碱和士的宁含量的方法，在最佳优化条件下，各组分分离度好，方法灵敏度较高。

所述的CE-TOF/MS法测定马钱子碱和士的宁含量的方法，其测试条件如下：

1）CE分离条件

CE背景缓冲液：30mM的乙酸铵溶液，pH=8.40；

进样方式：压力进样，0.5psi×10s；

有机调节剂：10%（v/v）的乙腈；

运行电压：反向25kV；

2）TOF/MS检测条件

鞘流液：由49.75%的去离子水、49.75%的异丙醇和0.5%的甲酸组成，v/v，流速为3μL/min；

雾化气压力：0.4Bar；

干燥气流速：4L/min；

干燥气温度：200℃。

其中，上述测试方法中，内标为盐酸小檗碱溶液。

马钱子碱和士的宁样品在测试前以固相萃取法对血浆和尿样样品进行固相萃取法前处理，活化平衡固相萃取小柱（如Waters Oasis MCX萃取小柱）后即可按照以下步骤进行：

1）上样：取酸化过的尿样和血浆样品1mL直接上样。

2）清洗：使用不同的溶剂作为清洗剂，考察各生物碱与杂质在小柱上的保留情况，通过选择清洗剂的种类、调整配比和洗脱顺序，达到既能较好的除去杂质，又能较好地保留药物的目的。

对尿样，依次用含5%的甲酸的0.1M盐酸水溶液、纯甲醇清洗；对血浆样，依次用2%的甲酸水溶液和1mL的纯甲醇清洗。

3）洗脱：血浆和尿样的洗脱采用5%氨水的甲醇溶液。

4）富集：60℃下氮气流缓缓吹干，吹干前先加入1%的盐酸水溶液；吹干后用样品溶剂（乙腈:水=1:4，v/v）复溶样品，以备进样分析。

本申请提供的分析血浆和尿液中的马钱子碱和士的宁含量的CE-TOF/MS测定方法，1）以固相萃取法对血浆和尿样样品进行前处理，除去大部分的蛋白和盐，同时浓缩待测组分；2）通过各项分析条件的优化，使检测方法快速简便，在1.0-100ng/mL浓度范围内，线性关系良好，最低检测限为0.06ng/mL；LLOQ、低、中、和高四个浓度水平质控样品的日内和日间精密度均在15%以下；血浆和尿样样品经过三次冻融后保持稳定，提取后的样品在常温下12h之内可保持稳定；3）与LC-MS方法相比较，本申请的CE-TOF/MS法在能够达到相当灵敏度的同时，改善了组分之间的分离，减少有机溶剂的使用量；与HPLC、CE-DAD方法相比较，本申请不仅灵敏度提高，而且还能够提供检测组分的精确分子量，可以实现对未知组分的定性。

附图说明