[发明专利]与四环素结合的蛋白TetR在检测四环素类抗生素中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及与四环素结合的蛋白TetR在检测四环素类抗生素中的应用。

背景技术

四环素类抗生素（tetracycline antibiotics)是由放线菌产生的一类广谱抗生素，包括金霉素（chlotetracycline)、土霉素（oxytetracycline）、四环素（tetracycline）及半合成衍生物甲烯土霉素、强力霉素、二甲胺基四环素等，其结构均含并四苯基本骨架。

四环素类抗生素具有如下应用：作为预防和治疗畜禽疾病的兽药，作为促进畜禽生长的饲料添加剂，在水产养殖业中用于治疗多种鱼类疾病，在乳业中用于提高奶牛产奶量，在养蜂业中用于预防蜜蜂的感染性疾病。四环素类抗生素过量使用不可避免的使母体、代谢产物等相关抗生素残留于动物的肌肉、蛋、奶、脏器组织中，影响人体健康。

鉴于抗生素的作用与危害并存，动物性食品中四环素族抗生素的残留问题受到关注，各国制定了动物源性食品中兽药最高残留标准和检测方法。我国2002年农业部发布的235公告中规定土霉素/金霉素/四环素在所有动物性食品的肌肉中的含量不得高于100μg/kg，在牛奶及羊奶中的含量也不能超过100μg/kg。

发明内容

本发明的目的是提供与四环素结合的蛋白TetR（又称TetR蛋白）在检测四环素类抗生素中的应用。

本发明公开了TetR蛋白在检测四环素类抗生素中的应用；所述TetR蛋白是如下（a）或（b）或（c）：

（a）由序列表中序列1自N末端第2至207位氨基酸残基组成的蛋白质；

（b）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（c）将（a）或（b）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与四环素类抗生素结合的由（a）衍生的蛋白质。

所述TetR蛋白可用于制备检测四环素类抗生素的试剂盒。

本发明还保护一种检测四环素类抗生素的试剂盒，包括所述TetR蛋白（包被原）。

所述试剂盒还包括洗涤液、样品稀释液、底物显色液和终止液中的至少一种。

每1升洗涤液可按照如下方法配制得到：将10ml吐温20、5g叠氮化钠和990ml磷酸盐缓冲液混合，得到洗涤液。所述磷酸盐缓冲液可为pH7.2-7.6、0.005M-0.015M的磷酸盐缓冲液，具体可为的浓度可为pH7.4、0.01M）的磷酸钠缓冲液。

所述样品稀释液可为pH7.2、0.1M的PBS缓冲液。

所述底物显色液包括显色液A和显色液B，可为独立包装的显色液A和显色液B，也可直接将显色液A和显色液B等体积混合得到。所述显色液可为过氧化氢溶液或过氧化脲溶液；所述显色液B可为邻苯二胺（OPD）溶液或四甲基联苯胺（TMB）溶液。所述显色液A具体可为2％（g/100ml）过氧化脲水溶液。所述显色液B具体可为1％（g/100ml）四甲基联苯胺水溶液。

所述终止液具体可为0.2M硫酸水溶液。

所述TetR蛋白可用于制备检测四环素类抗生素的试纸条。

本发明还保护一种检测四环素类抗生素的试纸条，由样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫组成；

沿试纸条的轴向，样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫依次按顺序连接，样品吸收垫的末端与胶体金垫的始端相连，胶体金垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连；

所述胶体金垫上包被有胶体金标记的N末端具有His标签的所述TetR蛋白；

所述反应膜上有检测区和质控区，检测区（T线）和质控区（C线）均为与试纸条轴向垂直的条带状；检测区位于靠近胶体金垫末端的一侧；质控区位于远离胶体金垫末端的一侧；检测区包被有包被原，质控区包被有His-tag单克隆抗体；所述包被原为四环素与载体蛋白的偶联物；

所述试纸条上还可具有样品孔，所述样品孔位于样本吸收垫上远离胶体金垫末端的一端。

所述载体蛋白具体可为卵清白蛋白（OVA）。

以上任一所述TetR蛋白具体可为采用以下方法制备得到的蛋白质：培养重组菌，得到所述与四环素结合的蛋白TetR；所述培养过程中加入IPTG作为诱导剂；

所述重组菌为将重组质粒导入大肠杆菌得到的重组菌。所述重组表达载体具体可为在载体pET28b的多克隆位点插入所述与四环素结合的蛋白TetR的编码基因得到的重组质粒。所述重组表达载体更具体可为在载体pET28b的NdeI和XhoI酶切位点之间插入所述编码基因得到的重组质粒。