[发明专利]一种改良性能的黄素单核苷酸结合荧光蛋白质

说明书

技术领域

本发明涉及的是修饰的荧光蛋白质，具体的来是一种在高温下有改良性能的黄素单核苷酸结合荧光蛋白质FbFP。

背景技术

绿色荧光蛋白质和其衍生物需要氧气来合成其生色团(Tsien，R.Y.Annu Rev Biochem 1998，67，509.)，从而限制了其在厌氧体系中的应用。来源于枯草芽孢杆菌的基于黄素单核苷酸结合的蓝色荧光蛋白质YtVA的发现为解决这一问题提供了新的途径(Losi，A.；Polverini，E.；Quest，B.；Gartner，W.Biophys.J.2002，82，2627.)，该蛋白质在厌氧和好氧微生物中都能发出荧光(Drepper，T.；Eggert，T.；Circolone，F.；Heck，A.；Krauss，U.；Guterl，J.K.；Wendorff，M.；Losi，A.；Gartner，W.；Jaeger，K.E.Nat Biotechnol 2007，25，443.)。YtvA由261个氨基酸组成，主要包括一个LOV(light，oxygen，voltage)亚基(残基25-126)和一个STAS(sulfate transporter/anti-σfactor antagonist，148-258)亚基(残基148-258)。在溶液中YtvA和LOV亚基都是以二聚体形式存在。其中包含LOV亚基的晶体结构(残基21-147)已经被解析(Moglich，A.；Moffat，K.J.Mol.Biol.2007，373，112.)，表明黄素单核苷酸结合在该亚基上是蛋白质的生色团。Drepper等发现，把暗状态下与黄素单核苷酸形成共价键的半胱氨酸C62突变成丙氨酸可以提高荧光量子产率(Drepper，T.；Eggert，T.；Circolone，F.；Heck，A.；Krauss，U.；Guterl，J.K.；Wendorff，M.；Losi，A.；Gartner，W.；Jaeger，K.E.Nat Biotechnol 2007，25，443.)；与YtVA相似，来源于恶臭假单胞菌的蓝色荧光蛋白质SB2的C53A突变体也提高了荧光亮度(Drepper，T.；Eggert，T.；Circolone，F.；Heck，A.；Krauss，U.；Guterl，J.K.；Wendorff，M.；Losi，A.；Gartner，W.；Jaeger，K.E.Nat Biotechnol 2007，25，443.)。这些研究成果被包含在德国专利DE102005048828A1中。德国公司Evocatal GmbH已经制造销售这些蛋白质，其产品名为对于来源于枯草芽孢杆菌荧光蛋白质命名系列，来源于恶臭假单胞菌的荧光蛋白质命名为系列。为了提高荧光亮度或者移动荧光发射频率，美国专利US20100304435A1对进行了突变改造，包括如下的一个或多个位点突变体：I29V，S91G，Y112F，E138G，L7P，F124L，N26Y，Y112H，I48T，H61Y，Y43F，Y112C，E12D，Q143L，A36T，Q57H，N95I，E22K，E71G，K88S，L109V，Q116L。与相比，其中4突变体E12D，H61Y，Y112F，Q143L有较好的荧光亮度增强(37％)，而5突变体E22K，E71G，K88S，L109V，Q116L则减小最强发射波长12纳米。在以下的描述中，我们简称基于黄素单核苷酸结合的蓝色荧光蛋白质为FbFP(flavin mononucleotide based fluorescence protein)。

FbFP可以在细胞内做荧光标记，用以研究基因表达调控，蛋白质定位，蛋白质相互作用，应用在生物传感器领域等。监测基因表达可以通过把编码荧光蛋白质的DNA与编码感兴趣基因的DNA相连，然后通过检测荧光来实现。蛋白质定位则可以通过把荧光蛋白质与感兴趣蛋白质相连，通过荧光检测来确定蛋白质所在亚细胞室的位置。而蛋白质相互作用则可以通过对感兴趣体系进行荧光蛋白质标记，然后使用荧光共振转移方法来研究。相比于传统的绿色荧光蛋白质，FbFP蛋白质还可以用来对厌氧微生物体系进行研究和高通量筛选。例如可以筛选用以抗癌治疗的厌氧菌。