[发明专利]一种表面展示重组蛋白的工程酿酒酵母活细胞镉吸附剂

说明书

技术领域

本发明涉及一种酿酒酵母活细胞镉吸附剂，尤其涉及一种表面展示T68CadR重组蛋白的工程酿酒酵母活细胞镉吸附剂。

背景技术

镉是一种毒性很强的重金属，进入人体后形成累积性中毒，导致骨质疏松和肾衰竭。镉及含镉化合物主要应用于电池、电镀、颜料及合金等行业，随着工业发展，镉污染也日益严重。

目前除了含镉废水的方法主要是物理化学法和化学法。其中物理化学法包括膜分离法和离子交换法，这些方法虽然去除效果好，但成本较高，难以大规模应用。化学法主要分为中和沉淀法、硫化物沉淀法和铁氧体法。中和沉淀法和硫化物沉淀法工艺简单，但容易造成二次污染。铁氧体法不易控制，在工业上难以广泛应用。

以上方法在处理低浓度含镉废水时都具有成本高的缺点，而且缺乏对镉的特异性，难以对镉进行选择性回收。

发明内容

提供一种表面工程酿酒酵母活细胞镉吸附剂，对低浓度镉有良好的选择性去除效果。

所述工程酵母表面展示（锚定）了T68CadR蛋白。

所述T68CadR蛋白，由野生CadR蛋白去除N端的47个氨基酸和C端的21个氨基酸而来。

附图说明

图1是本发明实施例的质粒构建示意图。

图2是本发明实施例测得的镉去除率随时间的变化曲线图。

图3是本发明实施例测得的镉和锌的吸附量。

具体实施方式

本吸附剂的制备方法是：

      1、T68CadR蛋白的设计

    由于CadR蛋白的N端为DNA结合结构域，而C端的21个氨基酸也不行使镉结合的功能，这些氨基酸对于镉吸附功能来说是冗余序列，因此本发明去除了CadR蛋白N端的47个氨基酸和C端的21个氨基酸，从而设计出T68CadR蛋白。

2、质粒的转化

以寡核苷酸TN47-F和TC21-R为引物，恶臭假单胞菌基因组DNA为模板进行聚合酶链式反应（PCR），扩增出具有5’和3’端分别具有EcoR I和Not I限制性酶切位点的T68CadR编码基因，将该基因片段克隆入载体pYD1，得到质粒pYD1-T68CadR（图1）。

      3、酿酒酵母的转化

      1）本发明采用酿酒酵母EBY100作为表面展示菌株，首先从YPD平板上挑取直径2-3mm的EBY100菌落，接入到10ml YPD液体培养基中，30℃恒温振荡培养16-18h；

2）将过夜培养的菌液接种于50ml YPD培养基中，调稀释至OD₆₀₀=0.4，继续30℃恒温振荡培养2-4h；

3）1800×g离心5min，弃上清后用40ml 1×TE重悬；

4）再次1800×g离心5min，弃上清后用2ml 1×LiAc/0.5×TE重悬，室温静置10min后即制成酵母感受态细胞；

5）取酵母感受态100μl，加入1μg质粒DNA及100μg人工处理的鲑鱼精子DNA并混合均匀，加入700μl 1×LiAc/40% PEG-3350/1×TE混合均匀，30℃ 180rpm恒温振荡培养30min；

6）加入88μl DMSO并混合均匀，42℃水浴热激7min；

7）10000×g离心30s，弃上清，用1ml 1×TE重悬菌体，取100μl菌液涂于选择性SD/-trp平板，30℃恒温培养48h。

4、T68CadR蛋白的表面展示

1）接种新鲜的酿酒酵母转化子于含有2％葡萄糖的YNB-CAA液体培养基中，30℃恒温振荡培养过夜至OD600为2-5；

2）1800×g离心5min，弃上清，使用含有2％半乳糖的YNB-CAA培养液重新悬浮菌体沉淀，调OD₆₀₀值为0.5~1.0；

3）20℃恒温振荡培养24h后，即完成T68CadR蛋白的表面展示。

下面以镉吸附实验为例，考察所述活细胞吸附剂对镉的吸附特性：

取成功表面展示T68CadR蛋白的菌液，调OD₆₀₀=4.0；1800×g离心5min，弃上清；先后用1×TE和50mM HEPES（pH 8.0）洗菌体各一遍，弃上清；用相同体积的Cd（II）浓度为1mg/L的50mM HEPES重悬菌体沉淀；30℃ 220rpm恒温振荡培养吸附2h；10000×g 离心1min，取上清；上清用1%硝酸溶液稀释10倍后用ICP-MS检测镉浓度。

镉去除率用如下公式计算：