[发明专利]一种龙血竭的生物活性检测方法

权利要求书

1.一种龙血竭的生物活性测定方法，包括以下步骤：

（1）供试品制备方法：

龙血竭低温粉碎，过40目筛，粉末5g加入40mL乙醇，常温超声提取25分钟，所得提取液使用滤纸过滤，滤液60℃水浴挥干乙醇，称量干燥物重量，计算回收率，干燥物溶入二甲基亚砜中，制备成相当于生药128mg/mL浓度的溶液，按照浓度比1:0.5连续稀释获得不同浓度的溶液；

（2）工作对照品的制备方法：

龙血竭对照药材，按供试品相同方法处理，获得工作对照品；

（3）分别进行龙血竭止血效价和活血效价的测定。

2.根据权利要求1所述的生物活性测定方法中止血效价实验，其特征在于：

（1）血浆的制备：家兔耳缘静脉血，取1.8mL与0.2mL 109mmol/L枸橼酸钠在直径10mm塑料试管内充分混合，2500r/min离心15min，取上清液即为所需血浆；

（2）血浆复钙时间的测定：直径10mm试管中将血浆与不同浓度的龙血竭溶液各0.1mL混合均匀，37℃预热3min，加入0.1mL预热到37℃的25mmol/L氯化钙溶液，启动秒表计时，缓慢倾斜试管混合，见到纤维蛋白丝出现，记录时间，为血浆复钙时间PRT，空白对照管使用0.1mL二甲基亚砜代替龙血竭溶液；

（3）按照下面公式计算血浆复钙时间缩短率：RP=（空白对照PRT-供试品PRT）÷空白对照PRT×100%。

3.根据权利要求1所述的生物活性测定方法中活血效价实验，其特征在于：

（1）血浆制备：血浆制备：取家兔耳缘静脉血，按体积比1:9加入3.28%枸橼酸钠抗凝，500r/min离心5min，取上清液为富血小板血浆（PRP）；继续离心，3000r/min离心10min，取上清液为贫血小板血浆（PPP）；

（2）加样和检测：取测定管放入搅拌珠，加PPP200μL，预热后对凝聚仪进行调零；受试药管加入PRP 180μL、药液20μL，空白对照管加入PRP180μL、DMSO20μL；分别预热5min后，加入10μL 0.04mol/L ADP磷酸缓冲盐溶液（pH7.4），2min后，记录并计算血小板聚集抑制率；

（3）按照下面公式计算，血小板聚集抑制率（AIR）=（空白对照血小板聚集率-供试品血小板聚集率）÷空白对照血小板聚集率×100%。

4.根据权利要求2、3中所述的效价测定方法中使用的剂量设置和统计方法，其特征在于：

依照《中国药典》2010版二部附录ⅩⅣ生物检定统计法，采用量反应的平行线测定法（2·2）法进行供试品与对工作对照品效价的对比检定：设定工作对照品的效价为1.0U/mg生药，剂量组之间浓度比r为0.5，各剂量组反应个数m相等。