[发明专利]白眉蝮蛇蛇毒纤溶酶的基因序列及其氨基酸序列

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛇毒蛋白纤溶酶编码基因序列及其氨基酸序列。 

背景技术

纤溶酶是指能专一降解纤维蛋白凝胶的蛋白水解酶，是纤溶系统中的一个重要组份。体内凝血和纤溶两系统是相互依存紧密相联的。机体一旦产生凝血反应，也几乎同时激活了纤溶系统，使体内多余的血栓移去，并通过负反馈效应使体内纤维蛋白原的水平降低，从而避免纤维蛋白的过多凝聚。蛇毒纤溶酶的分布是十分广泛的，有报道称几乎所有的响尾蛇毒均有纤溶组分。Fuffado等曾检测了9种矛头蝮蛇蛇毒发现均含有纤溶活性。迄今为止已从蝰科眼镜蛇科及游蛇科的多种蛇毒中获得了纯化的纤溶酶，其中分布最广，含量最丰富的是蝰科中的蝮亚科蛇毒纤溶酶，能直接降解纤维蛋白原的Aα或Bβ链，使其即使在凝血酶存在下也不凝固，大多数可以溶解纤维蛋白根据它优先降解纤维蛋白原Aα或Bβ肽链分为α纤溶酶和β纤溶酶。纤溶酶一般只作用于Aα或Bβ肽链。根据纤溶酶结构特点还可分为丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。 

目前国内临床上所使用的纤溶酶均为从动物体内提取，纯度不高，具有一定的抗原性，进入人体后，可能诱发一系列的抗原抗体反应，已有报道注射纤溶酶导致固定性药疹及重症多形红斑药疹，且不能实现静脉注射给药，使药物不能最大限度发挥作用。经过多年的临床实践，发现白眉蝮蛇蛇毒类纤溶酶有最好的疗效。然而蛇毒资源是非常有限的，如果通过基因工程来获得产品，则是一个很有前途的途径。为了今后基因工程产品的开发，对白眉蝮蛇蛇毒纤溶酶进行基因序列 测定是一项有意义的研究课题。 

为此，本发明的目的是通过测定白眉蝮蛇蛇毒类纤溶酶N端的一段氨基酸序列，根据这段序列及其它蛇种纤溶酶在结构上的同源性，设计并合成上下游寡核苷酸引物，然后从白眉蝮蛇蛇毒腺中分离有关的m RNA作为模板，经反转录获得c DNA，用PCR法扩增和克隆了纤溶酶的全基因，分析测定基因的全序列。 

发明内容

本发明的目的在于提供白眉蝮蛇蛇毒纤溶酶的编码基因序列。 

本发明的另一个目的是提供白眉蝮蛇蛇毒纤溶酶的氨基酸序列。 

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案： 

1、总RNA提取 

切下蛇头，立即取出毒腺，与液氮中速冻，置于-70℃备用，采用酸性硫氰酸胍-酚-氯仿一步法(参阅Chomczynski P.et al.Analytical Biochemistry.1987，162：156)抽提毒腺总RNA。 

2、引物设计依据，引物合成的方法 

根据测定的纤溶酶成熟蛋白N端的氨基酸序列，结构为VIGGDECNINEHRSL，设计了上游寡核苷酸引物，即5’GTCATTGGAGGTGATGAATGTAACATA 3’；根据其它蛇种纤溶酶结构上的同源性(Arinos Magalhaes.，Beatriz Campos Brasil Da Fonsecaa，et al，1993.The complete amino acid sequence of a thrombin-like enzyme/gyroxin analogue from venom of the bushmaster snake(Lachesis muta muta).Eur.J.Biochem.251，845 853.)在3’端的保守区段设计了下游寡核苷酸引物，即： 

5’TCACGGGGGGCATGTCA 3’。引物在上海生工生物技术有限 公司合成，引物见图2。 

3、反转录、PCR扩增和基因克隆 

以白眉蝮蛇毒腺总RNA为模板，下游引物为引物作反转录。反转录试剂盒购自天根生化科技有限公司，操作按其说明书进行。从前步所得c DNA为模板，以合成的上下游引物进行PCR扩增。PCR扩增出一条约700bp的DNA片段，见图3琼脂糖凝胶电泳图谱。采用天根生化科技有限公司的胶回收试剂盒回收该PCR产物。将回收的PCR产物插入pGEM-T easy载体(质粒载体购自Promega公司)，并转入DH 5α大肠感受态细胞，经蓝白斑筛选和酶切鉴定，获得10个阳性克隆。将阳性重组克隆经pGEM-T easy载体克隆位点上、下游通用引物进行DNA测序，得到本发明的的白眉蝮蛇蛇毒纤溶酶编码基因的DNA(mRNA)序列。使用DNAMAN软件，根据这个蛇毒纤溶酶编码基因的DNA(mRNA)序列，得出该蛇毒纤溶酶的蛋白质的一级结构(氨基酸序列)。