[发明专利]筛选生产底物广泛性的腈水解酶的菌株的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从土壤、环境污染物、水体等样品中筛选获得能够生产具有较好的底物广泛性、能够水解羟基腈、普通腈类及芳香腈类的腈水解酶的菌株的方法。

背景技术

腈水解酶包括腈水解酶(Nitrilase)和腈水合酶(Nitrile hydratase)，前者可以催化腈直接水解生成羧酸及氨；而后者可以催化腈水解生成酰胺，酰胺在酰胺酶(Amidase)作用下进一步转化成羧酸及氨。传统化学方法利用腈类合成相应羧酸类需要在强酸性、高温环境中进行，而且合成过程中会有大量的副产物产生，合成效率低下，分离产物困难。利用腈水解酶(包括菌体及纯化后蛋白质)催化腈化物的水解具有高选择性、高效性、条件温和、环境污染小、成本低、产物光学纯度高等优点，与传统的化学方法相比，有着无可比拟的优越性。利用腈水解酶降解腈化合物，用于合成手性的羧酸和酰胺等医药中间体，此外腈水解酶及其产生菌还可用于食品、电镀厂等腈污染废水的生物治理。腈水解酶可广泛应用于精细化工、医药、食品、农业及畜牧业等方面。

来源于绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis B23)及红球菌(Rhodococcus rhodochrous)J1的腈水解酶已经应用于工业生产，使得年产丙烯酰胺达30000吨以上。经证实在不同属(农杆菌属、节杆菌属、棒杆菌属、假单胞菌属和红球菌属)的若干细菌种中都有腈水解酶存在，并从多种生态系统中得以分离，例如，热湖的沉积物、深海沟渠、腈污染的土壤等。此外，黑曲霉(Aspergillus niger)、串珠赤霉菌(Gibberella moniliformis)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)的几个真菌菌属中，也发现腈类降解活性的报道。底物广泛性良好的腈水解酶在除去食品、饮料及环境中腈类污染的治理方面存在着独特的优势，具有重要的开发价值。

目前腈水解酶的筛选方法多采用2-羟基腈类如2-羟基乙腈、2-羟基丙腈等作为筛选压力筛选具有较好的催化专一性的腈水解酶，用于催化合成高纯度、具有旋光性的手性化合物。但这些筛选方法都不能获得底物广泛性的腈水解酶。到目前为止，未发现筛选具有较好的底物广泛性的腈水解酶的方法报道。本方法利用3-羟基丙腈作为筛选压力和筛选氮源，充分利用β-位羟基的结构，使得筛选到的腈水解酶菌株所产腈水解酶既能够降解普通腈类，又能够降解羟基腈和带芳香环的腈类，具有较好的底物广泛性。

经检索国内外没有以3-羟基丙腈作为筛选压力和氮源筛选产腈水解酶的菌株的方法及筛选底物广泛性腈水解酶的方法。

发明内容

本发明针对现当前腈水解酶市场需求，特别是对于具有底物广泛性腈水解酶的需求，以三羟基丙腈作为筛选压力和氮源，利用Berthelot显色法进行初步测定，结合高压液相对高效产氨菌株进行进一步确认，建立了筛选生产底物广泛性的腈水解酶的菌株的筛选方法。本方法既通过Berthelot显色法提高了筛选的效率，又通过高压液相保证了筛选的准确度，经检验利用三羟基丙腈筛选到的菌株所生产的腈水解酶都具有较好的底物广泛性。

本发明还涉及通过上述筛选方法筛选得到的菌株。通过本发明的筛选方法筛选到的菌株主要属于假单胞菌属、泛菌属。

本发明还涉及由所筛选的菌株所产生的底物广泛性的腈水解酶。

具体地，本发明涉及一种筛选生产底物广泛性的腈水解酶的菌株的方法，本筛选方法的关键是采用三羟基丙腈作为筛选压力和氮源，所述方法包括下述步骤：

(1)活化步骤，将经水洗后的固体样品的水洗液或者液体样品于25℃～37℃放置12～24小时；

(2)初步富集步骤，在活化步骤后向样品中添加1％～2％的含三羟基丙腈的选择性筛选液体培养基；

(3)再富集步骤，取1ml经初步富集的样品接种到选择性筛选液体培养基中，在37℃继续富集培养12～24小时后，取50～200μl富集培养液涂布于选择性筛选培养基固体平板，经36～72小时获得单菌落；