[发明专利]一种固相合成磷酰二胺吗啉代寡核苷酸及方法

权利要求书

1.一种固相合成磷酰二胺吗啉代寡核苷酸，其特征是采用了王树脂作为固相载体，末端羟基用叔丁基二甲基硅保护的磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)结构：

所述PMO-王树脂的结构：

其中碱基B的结构为：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)四种碱基的任意一种。

2.如权利要求1所述的固相合成磷酰二胺吗啉代寡核苷酸，其特征是所述PMO-王树脂结构中，上下两端的碱基B为相同的或是不同的一种碱基；复单元中的碱基B是这四种碱基的其中一种或者任意的排列组合。

3.如权利要求1所述的固相合成磷酰二胺吗啉代寡核苷酸，其特征是所述的PMO-王树脂的结构为：

n=1，碱基B分别为腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)的PMO(A-T)-王树脂的结构：

4.如权利要求1所述的固相合成磷酰二胺吗啉代寡核苷酸，其特征是所述的PMO-王树脂的结构为：

n=2,碱基B分别为腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)的PMO(A-T)-王树脂的结构：

5.如权利要求1所述的固相合成磷酰二胺吗啉代寡核苷酸，其特征是所述的PMO-王树脂的结构为：

n=3,PMO(G-C-A-T)-王树脂的结构：

6.如权利要求1所述的固相合成磷酰二胺吗啉代寡核苷酸的方法，其特征是具体反应步骤如下：

1）含有一种碱基基团B的吗啉代衍生物和叔丁基二甲基氯硅烷的摩尔投料比为1/1.3，溶于二氯甲烷中，二氯甲烷用量足够将吗啉代衍生物和叔丁基二甲基氯硅烷溶解即可；在室温搅拌下加入咪唑，咪唑的加入量和吗啉代衍生物的摩尔比为3/1；反应5个小时后反应物用水洗涤，用无水硫酸钠干燥，去除溶剂后得到粗品产物为无色的油；

2）第一步反应产物无色的油溶于含有乙酸的三氟乙酸中，乙酸和三氟乙酸的体积比为1/50，搅拌4个小时，之后去除溶剂得到白色固体；

3）第二步反应产物白色固体溶于体积比为1∶1的水和二氧六环中，在室温加入碳酸钠；反应物搅拌过夜后用水和二氯甲烷洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，去除溶剂，粗品经过柱层析法纯化后得到白色固体；

4）王树脂放入一个固相合成管里，然后加入第三步反应产物白色固体，王树脂和第三步反应产物白色固体的摩尔投料比为1/1，二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶与第三步反应产物的摩尔投料比分别为1.3/1和0.35/1；固相合成管放置在摇床上反应12个小时，然后固相树脂用大量二氯甲烷洗涤，得到产物；

5）向装有第四步反应产物的固相合成管里加入四丁基氟化铵四氢呋喃溶液，溶液浓度为100毫克/毫升；然后固相合成管放置在摇床上反应4个小时，固相树脂用四氢呋喃和二氯甲烷洗涤后得到产物；

6）含有一种碱基基团B并且用磷酰二胺活化后的吗啉代衍生物和第五步反应产物反应，摩尔投料比范围为2-9/1，溶于浓度为50毫克/毫升的三乙胺二氯甲烷溶液中，放入固相合成管里；过夜反应后用大量二氯甲烷洗涤得到产物；

7）向装有第六步反应产物的固相合成管里加入浓度为100毫克/毫升的四丁基氟化铵四氢呋喃溶液；然后固相合成管放置在摇床上反应4个小时，固相树脂用四氢呋喃和二氯甲烷洗涤后得到产物。

7.如权利要求6所述的固相合成磷酰二胺吗啉代寡核苷酸的方法，其特征是根据不同碱基B的吗啉代单体个数（n+1），重复n次第六步、第七步反应，将（n+1）个不同碱基B（1,2,3,4）的吗啉代单体通过磷酰二胺进行连接，最后在氨水条件下将产物从王树脂这一固相载体上切下来，得到磷酰二胺吗啉代寡核苷酸。

8.如权利要求6或7所述的固相合成磷酰二胺吗啉代寡核苷酸的方法，其特征是n=1，第一步反应中碱基基团B为腺嘌呤(A)，第六步反应中碱基基团B为胸腺嘧啶(T)，在氨水条件下将第七步反应产物从王树脂这一固相载体上切下来，得到磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(A-T)。