[发明专利]一种纯化胸腺素β4的方法

说明书

技术领域

本发明属于反相HPLC技术领域，尤其是涉及一种批量化产业化纯化胸腺素β4（Thymosinβ4）的方法。

背景技术

胸腺素β4是20世纪80年代从胸腺中分离得到、后来发现在许多组织中都广泛存在的一种小肽类物质，其是一种重要的肌动蛋白结合蛋白，含有43个氨基酸，分子量约5kD，等电点为5．1，在哺乳动物中具有较高的保守性。胸腺素β 4是一种由43个氨基酸组成的小分子蛋白，具有很强的上皮细胞刺激和再生作用，对胚胎期的心脏发育中起着重要的作用。胸腺肽-β4(thymosin-β4, Tb4)最初是从小牛胸腺组分Ⅴ中分离提纯得到。胸腺素β4后发现存在于除了红细胞以外的几乎所有的体细胞中，血小板含量最高，在血浆和组织液中也有分布，具有较强的上皮组织修复作用。目前，美国Regene RX公司开发化学合成胸腺素β-4，其“大泡性皮肤松弛症”的研究已进入Ⅱ期临床试验。

近年来,胸腺素β4的促进创伤愈合作用受到关注。最近的研究发现,在心肌、角膜和皮肤的创伤愈合过程中,胸腺素β4主要是作为一种化学诱导因子,调节多种生长因子的表达以及趋化新生细胞的迁移。由于机体自身修复愈合的能力极其有限,一旦发生损伤或者病变很难自愈,甚至导致溃疡或瘢痕形成,多需要外缘性修复或启动内源性修复,但目前尚未发现有效的促进创伤愈合的药物，胸腺素β4为创伤愈合药物的研究提供了一个新方向。

最初从小牛胸腺中分离得到的胸腺素5(Thymosin fration 5,TF5)，根据其再等电聚焦电泳分析图谱上的位置，可划分为αβγ三个区：α区pI<5，β区pI<5~7之间，γ区pI>7。如胸腺肽α1可以增强机体细胞免疫功能，已经用于临床治疗。最新研究发现，胸腺素β4（Thymosinβ4，Tβ4）不仅参与免疫过程，而且表现出多重生物学功能，引起了研究者的广泛关注。正是由于Tβ4产品这一系列中药的生物学应用前景，分离纯化得到Tβ4产品用于进一步的科学研究就显得尤为重要。目前在我国，对于Tβ4分离纯化工艺的研究相对较少。《中国新药杂志》2008年第22期：采用硫酸铵沉淀法制得胸腺素5粗提品,然后利用阴阳离子交换色谱纯化得到胸腺肽β4产品,并采用SDS-PAGE和HPLC法进行分析鉴定。结果：分离纯化得到了纯度为90.1%的产品。该方法所得的胸腺肽β4的纯度远远不够目前药物研究的纯度要求。

目前, 国内利用反相高效液相色谱法对固相合成的胸腺素β4进行分离纯化的文献相当少，所以利用反相高效液相色谱法对固相合成的胸腺素β4进行分离纯化，得到大量的高纯度的胸腺素β4，成了急需解决的技术问题。本发明目前不但解决了从机体组织中分离得到胸腺素β4的困难，而且也能得到符合药物研究所需要的高纯度成品，对其在药物的研究上以及它的作用上可以提供有效的帮助。

发明内容

本发明的目的在于提供一条适于产业化纯胸腺素β4的方法，主要解决现有技术分离得到胸腺素β4纯度较低的技术问题。

 为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种纯化胸腺素β4的方法，包括如下步骤：

 1） 将固相合成所得粗肽用去离子水溶解，固定相为反相硅胶柱，流动相为磷酸盐缓冲溶液为A相，色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，收集目的峰值的肽溶液；

2) 将纯化后的高纯度肽溶液采用HPLC转盐法交换转成醋酸盐；

3）将最终的高纯度肽溶液减压旋蒸浓缩冷冻干燥，得粉末状成品。

更为优选的方案是：所述A相的磷酸盐缓冲液的pH为3.5~4.8。

更为优选的方案是：所述色谱纯乙腈的质量百分浓度为20-65%，检测波长为220nm。

更为优选的方案是：所述的反相硅胶柱为四烷基硅烷键合硅胶或十八烷基键合硅胶的反相硅胶。

更为优选的方案是：所述的HPLC转盐法，pH为2.0~3.0的醋酸溶液和色谱纯甲醇的两相溶液，色谱柱为四烷基硅烷键合硅胶或十八烷基键合硅胶的反相硅胶柱。

本发明的有益效果是：本发明的提出的一条适于产业化纯胸腺素β4的工艺方法，使用反相高效液相色谱法纯化胸腺素β4，并用HPLC转盐法交换转盐，不仅能得到HPLC纯度大于98.0%的精肽，而且可以批量化生产，达到纯度高，收率高，成本低，效率快的要求。

具体实施方式

实施例1

1．  样品处理：将合成所得的胸腺素β4用去离子水溶解（溶解浓度约为50mg/ml），用孔径为0.45um滤膜过滤后收集滤液备用。

2．  纯化