[发明专利]斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗的制备方法

权利要求书

1.斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗制备方法，其特征在于：

A、疫苗的抗原为嗜水气单胞菌和嗜麦芽寡养单胞菌两种病原细菌，将灭活完全的菌体按等比例混合制成斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗；

B、用二联疫苗对斑点叉尾鮰鱼体浸泡接种或注射接种免疫。

2.根据权利要求1所述的斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗制备方法，其特征在于：所述菌种包括从发病斑点叉尾鮰体内分离出来的嗜水气单胞菌和嗜麦芽寡养单胞菌。

3.根据权利要求1所述的斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗制备方法，其特征在于：其制备方法按以下步骤进行：

（1）将嗜水气单胞菌和嗜麦芽寡养单胞菌分别接种到TSA，30±0.5℃培养24小时；

（2）分别将步骤（1）培养好的菌体，接种到无菌TSB中，在震荡摇床中进行液体培养，培养温度为30±0.5℃，摇床速度280~300r/min，培养时间为24小时；

（3）将步骤（2）中培养好的菌体分别在常温下3500r/min离心30钟，弃上清液，用无菌的0.85%的生理盐水稀释菌体到10⁸或10⁹CFU/ml；

（4）取出步骤（3）中稀释得到菌液，加入福尔马林溶液灭活，使福尔马林的最终浓度为0.3%（V/V）， 32±0.5℃下灭活72小时；

（5）根据斑点叉尾鮰的发病规律及程度，将以上两种灭活菌液以等比例混合制成斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗，置4℃冰箱内储藏。

4.根据权利要求1所述的斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗制备方法，其特征在于：按以下步骤进行：

（1）在具有典型出血性肠套叠斑点叉尾鮰病鱼体内分离出嗜水气单胞菌和嗜麦芽寡养单胞菌，将两菌分别接种到无菌TSA上，30±0.5℃培养24小时；

（2）分别将步骤（1）培养好的菌体，接种到无菌TSB中，在震荡摇床中进行液体培养，培养温度为30±0.5℃，摇床速度280～300r/min，培养时间为24小时；

（3）将步骤（2）中培养好的菌体分别在常温下3500r/min离心30钟，弃上清液，用经无菌的0.85%的生理盐水稀释菌体到10⁸或10⁹CFU/ml；

（4）取出步骤（3）中稀释得到菌液，加入福尔马林溶液灭活，使福尔马林的最终浓度为0.3%（V/V）， 32±0.5℃下灭活72小时；

（5）根据斑点叉尾鮰的发病规律及程度，将以上两种灭活菌液以等比例混合制成斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗，置4℃冰箱内储藏。

5.根据权利要求1所述的斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗，其特征在于：所述的浸泡接种或注射接种为：

A、浸泡接种，取二联疫苗于容器中，加入蜂胶佐剂，再加入无菌水，使疫苗稀释200倍，佐剂的最终浓度为0.1mg/ml，搅匀后将鱼投入容器内浸泡接种疫苗15～30分钟；

B、注射接种，将二联疫苗用0.85%的无菌生理盐水稀释5倍 ，加入蜂胶佐剂，使其最终浓度为0.01mg/ml，溶解摇匀后，用注射器向鱼体腹腔注射，用量为8～10厘米的鱼种0.1～0.3ml/尾。

6.斑点叉尾鮰肠套叠的免疫方法，其特征在于：将灭活完全的嗜水气单胞菌和嗜麦芽寡养单胞菌两种病原细菌菌体按等比例混合制成斑点叉尾鮰肠套叠二联灭活疫苗的应用。