[发明专利]一种基因在培育抗百草枯转基因植物中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有百草枯抗性的转运体蛋白及其编码基因在转基因植物中的应用。 

背景技术

百草枯(paraquat，1,1'- 二甲基 -4,4'- 联吡啶二氯化物，methyl viologen)在农业中广泛应用已近50年，作为非选择性除草剂应用在世界范围内超过100个国家，受到广泛接受与欢迎。90年代以来，随着农业生产的需求，我国若干农药企业先后开始规模生产百草枯原药，并不断的改进生产工艺，产品在各地推广应用，在生产中发挥了一定的作用。 

百草枯是继草甘磷之后的第二大除草剂，是一种速效触杀型除草剂，兼有一定内吸作用，主要用于果园、桑园、茶园、林带等作物的杂草，估计将来的应用呈上升、递增趋势。百草枯是典型的光合系统I抑制剂，其活性的发挥决定于光，植物对其吸收非常迅速，因而喷药后短期内降雨不影响药效的发挥；吸收的药剂通过木质部中的逆向流进行传导，在适宜条件下，大量药剂被叶片吸收并向其他部位传导，此种传导仅仅是非原质体(木质部)传导，因而叶面处理的百草枯通常停滞于被处理的叶片内。毒理学机理研究表明，百草枯的生物毒性与致突变性的原因是，双氧化合物存在时，百草枯被还原并重新被氧化，在此循环反应过程中产生负自由基O2^-并在活细胞体内积累。Baldwin等人的研究结果表明，进入大肠杆菌中的百草枯，被胞质中的NADPH^-依耐性硫辛酰胺脱氢酶还原成单价正自由基PQ⁺，随后与氧作用产生负自由基O₂-（k2=7.7x108M-1s-1），Farrington 等人的研究结果也证实这条途径。Ju-Fang Ma等人从一株铜绿假单胞菌中克隆到6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf，该基因对百草枯产生的负自由基O₂^-具有有效的脱毒作用。Su Mei Kao等人通过对一株具百草枯抗性的大肠杆菌突变株的研究，初步探讨了该除草剂在微生物体内的转移、转化规律。 

百草枯4,4' -位阳离子的存在使得它具有很强的还原性，是强氧化剂，强氧化剂的不稳定性又使它的研究受到了一定的限制，在原核生物中研究较多，但在真核生物尤其是植物中很少。随着该试剂的使用，具有抗性的植株出现。12-15年后发现了第一例抗性杂草(Powles and Cornic, 1987)。据多年数据显示，生物对抗百草枯可能与其体内的转运体有关。转运体蛋白广泛存在于原核生物和真核生物中，其中一些是有害物质的外排泵，在生物体排出环境中或自身代谢产生的有毒物质过程中起到重要作用。研究表明，原核生物的转运体蛋白PrqA、 PotE 、EmrE 能转运、隔离并除去PQ等毒性分子，以降低作用于靶标的药物浓度从而达到解毒的作用。 

转运体蛋白在植物中的转化研究与应用情况的研究主要停留在实验室阶段， Jinki Jo等人将无色杆菌中的pqrA基因转进烟草中，并得到了很好的表达，对比于野生株转基因烟草具有对百草枯较高的抗性，而且烟叶中的残留量也相当少。 

与抗草甘磷的转基因植物相比，至今抗百草枯转基因植物的商品化产品不多。前面提到的Jinki Jo等人研究的pqrA基因转烟草植株在和野生型烟草相比, 野生型生长在半固体培养基中当百草枯为1μM浓度时即出现枯萎，百草枯达20μM浓度时植株即死亡，而转基因烟草仍然是正常生长。在百草枯浓度20μM和50μM的情况下，在野生型烟草的叶片中叶绿素含量损失约80% ，而转基因烟草的叶片中叶绿素含量损失不超过15% 。 

目前关于百草枯抗性基因在植物中的转化研究与应用情况的研究主要停留在实验室阶段，与抗草甘磷的转基因植物相比，抗百草枯转基因植物的商品还未出现。所以，进行百草枯抗性基因研究及其转化植物体系的建立是十分必要的。 

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供新的使植物具有农药百草枯抗性的蛋白质。另外，本发明还提供了编码这些蛋白质的核酸以及基因工程中间体（如，表达盒、载体和细胞等），获得具有含百草枯成分农药抗性的植物和微生物的方法和应用，并且提供了判断植物和微生物是否采用本发明方法获得的鉴定方法。