[发明专利]一种胚性材料的超低温冷冻保存复苏方法

权利要求书

1.一种胚性材料的超低温冷冻保存复苏方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取待保存的胚性材料，按10%的接种量接入高渗液体培养基，25℃，培养3~10d；其中，高渗液体培养基为添加有0.1~0.8mg/L山梨醇的M13基本培养基；

（2）过滤步骤（1）预培养的胚性材料，装入冷冻管，向冷冻管中加入复合玻璃化保护剂，0℃，放置脱水0～70min，然后装入冷冻盒直接投入液氮速冻，液氮中长期保存；复合玻璃化保护剂为添加30%甘油和30%乙二醇的M13基本培养基；

（3）从液氮中取出冷冻盒，迅速将冷冻管置于35~43℃水浴中，快速化冻2min；吸去复合玻璃化保护剂，向冷冻管加入1mL的高渗愈伤增殖培养基，停留2min，数次重复洗涤；高渗愈伤增殖培养基为添加0.1~0.5M蔗糖的M13基本培养基；

（4）把洗涤后的胚性材料迅速转移到垫有滤纸的高渗愈伤增殖培养基，25℃，培养1~6d； 

（5）转胚性材料至低渗愈伤增殖培养基上培养1~6d，长出新的愈伤组织，然后转移到愈伤增殖培养基上进行培养；低渗愈伤增殖培养基为添加0.1~0.4M蔗糖的M13基本培养基；

（6）转移长有新的愈伤组织的胚性材料至体胚诱导培养基上培养，直至高频体细胞胚胎发生即可。

2.据权利要求1所述的胚性材料的超低温冷冻保存复苏方法，其特征在于：步骤（1）中，培养6~8d。

3.根据权利要求1所述的胚性材料的超低温冷冻保存复苏方法，其特征在于：步骤（1）中，在所述的高渗液体培养基中还加有1~5mg/L ABA和50~200mg/L脯氨酸。

4.根据权利要求1所述的胚性材料的超低温冷冻保存复苏方法，其特征在于：步骤（2）中，所述的放置脱水，为先用60% PVS2保护胚性材料过渡脱水0~10min，然后转到100% PVS脱水0~60min，然后再投入液氮保存。

5.根据权利要求1所述的胚性材料的超低温冷冻保存复苏方法，其特征在于：步骤（3）中，37℃水浴。

6.根据权利要求1所述的胚性材料的超低温冷冻保存复苏方法，其特征在于：步骤（3）中，高渗愈伤增殖培养基为添加0.6mol/L山梨醇的M13基本培养基。

7.根据权利要求1所述的胚性材料的超低温冷冻保存复苏方法，其特征在于：步骤（4）中，蔗糖浓度为0.4M，培养2d。

8.根据权利要求1所述的胚性材料的超低温冷冻保存复苏方法，其特征在于：步骤（5）中，蔗糖浓度为0.3M，培养5d。

9.根据权利要求1所述的胚性材料的超低温冷冻保存复苏方法，其特征在于：步骤（6）中，培养3个月，就可以实现高频体细胞胚胎发生。