[发明专利]一种改进的植物线虫永久玻片制作方法

说明书

技术领域

本发明属于植物线虫标本制作技术领域，具体为一种改进的植物线虫永久玻片制作方法。

背景技术

植物线虫属于无脊椎动物中的线虫门，是一类寄生于植物根、茎、叶、果实、种子等部位的线虫，其种类繁多、分布广泛、寄主多样、危害严重。据不完全统计，全世界每年因植物线虫造成的农林作物经济损失在数千亿元以上。近年来，随着国际间贸易往来的日益频繁，进出境种苗及其植物繁殖材料增多，各种植物病害尤其是线虫病害传播的机会大大增加，使得植物线虫成为世界各国广泛关注的对象。

在植物线虫研究工作中，永久玻片制作作为最经典实验技术之一，可将线虫标本长期保存下来，以便进一步线虫形态结构观察、各种数据的测量及分类鉴定，尤其对鉴定的新种模式标本更为重要。如果玻片效果不佳，则后续得到的结果可信度将大打折扣，因此制作好的植物线虫永久玻片是进行传统的以形态特征为基础的分类和鉴定研究的前提条件。

目前，线虫永久玻片标本的制作程序较为复杂，具体步骤如下：①杀死目标线虫：需将目标线虫悬浮液内加沸水使温度为56-58℃以热杀死线虫。该法中目标线虫需是活的，最好是刚从土壤或植物组织中分离出的，若分离出的目标线虫放置过久而没有固定或固定时间短，会使线虫变形。②线虫的固定：室温自然降温后，再加TAF固定液（福尔马林10ml+冰醋酸1ml+甘油2ml+蒸馏水87ml）以固定线虫形态。③线虫的脱水：有乳酚油法、甘油-乙醇法和4：1FG固定液法3种方法较为常用。乳酚油法，即取一洁净凹玻片，在凹穴内加满乳酚油(苯酚20ml+乳酸20ml+甘油40ml+蒸馏水20m1)；将凹玻片置于65-70℃电热板上预热；把固定1d以上的线虫挑至热的乳酚油中2-3min即可。该法在操作中涉及强毒性化学试剂苯酚，具一定的危险性，且标本置于光下易遭破坏。甘油-乙醇法，即将已固定的线虫挑入有0.5-1ml溶液Ⅰ(95％乙醇20ml+甘油1ml+蒸馏水79ml)的小皿中；在干燥器内注入95％乙醇至器积的1/10左右，把上述小皿置于干燥器内并盖上干燥器盖；把干燥器放入35-40℃烘箱，12h后移出；打开干燥器盖，去掉小皿中大部分溶液后，用溶液Ⅱ(甘油5ml+95％乙醇95ml)加至小皿满为止；将小皿放到一个大培养皿中，40℃烘箱l2h，直至最后小皿中只剩下甘油为止。该法线虫脱水时主要依靠经验，易形成蒸发过快引起线虫扭曲变形。4：1FG固定液法，即把固定线虫的小皿放入40℃烘箱内，盖子留有缝隙，让水分不断蒸发；视蒸发情况，及时补加同温下预热的该固定液，用量一般占小皿体积的2/3；通过不断的“蒸发一添加”，直到小皿中水分完全蒸发掉，只存留少量甘油为止。该法在操作中主要依靠经验，且耗时过长，约需5-6周。④制片：用一直径为1.5cm的干净打孔器在酒精灯火焰上加热，立即蘸取少量石蜡凡士林混合体（8份石蜡和3份凡士林在65℃下混匀即可），并在一洁净载玻片中央轻按，待冷却后即为一蜡环；在蜡环内滴一小滴纯甘油；在体视显微镜下用挑针将已完全脱水的线虫移至载玻片上纯甘油滴的中央，用针均匀排列并将其沉下底；用挑针蘸3根与线虫粗细接近的玻璃纤维丝，呈三角形排列在线虫的边缘，以防标本干瘪或压扁虫体；取一洁净的盖玻片，在酒精灯火焰上轻烤数秒后盖于纯甘油滴上方；将此载玻片移至65-70℃加热板上加热，直至石蜡凡士林混合剂融化；将载玻片移至实验台冷却，再用中性树脂、阿拉伯胶等封片剂封片；待封片剂干燥后贴上标签即可。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种改进的植物线虫永久玻片制作方法的技术方案，其方法简便、环保、可操作性强。

所述的一种改进的植物线虫永久玻片制作方法，其特征在于包括以下步骤：

1）线虫的杀死与固定：将分离的新鲜线虫挑入盛有适量水的小皿内，将盛有固定液的试管置于盛有沸水的烧杯中水浴为3-5min，在体视显微镜下用移液器小心吸出线虫小皿内的水层至皿底，取水浴中的固定液迅速加入小皿中，热杀死并固定线虫7-9天；所述的固定液由体积比的以下物质组成：40%甲醛6-10%、纯甘油1-5%、蒸馏水85-93%；