[发明专利]一种耐盐紫花苜蓿的构建与培育方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，属于生物转基因技术，特别是一种耐盐紫花苜蓿的构建与培育方法。

背景技术

随着世界人口的增加和人民生活水平的提高，人们对农业生产有着日益增长的需求。人类已经将森林和草原改造为农田，将处于生态边缘的干旱和半干旱土地用人工灌溉生产粮食。这些活动的间接后果就是地表盐分的升高，在全世界大约有25%的农田已经沦为盐碱地，仅发明者所处的宁夏地区就有80多万亩的盐碱荒地和150多万亩的盐碱低产地，而且它们的面积还在逐年扩大。

现有改善盐碱地的主要方法是用工程方法构建排水网络，使地表盐分随灌溉水或天然降雨流入低处。最近亦有人尝试将燃烧过的含硫煤渣掺入盐碱土，改善的土壤环境，促进植物生长。但所有这些工程法都需要大量的先期投入。在农业生产相对附加值减少，经济市场化的趋势下，这些方法很难普遍实行。

紫花苜蓿具有非常高的经济价值，被称为“畜草之王”。它是多年生豆科植物，它有较深的根系并可以固氮，是改良土壤的常用作物。但是，一般紫花苜蓿虽然具备了改良盐碱地的基本条件，但是抗盐的能力非常有限。

转基因工程利用农杆菌质粒将特定基因转移至植物内部的技术已经成熟。

                                        

发明内容

本发明的目的是克服现有技术缺陷，提供一种构建和培育耐盐紫花苜蓿的方法。

本发明的目的按照下述方案实现：一种构建和培育耐盐紫花苜蓿的方法，包括以下步骤：（1）选择易于产生离体叶胚性愈伤组织的紫花苜蓿品种；（2）选择适于紫花苜蓿叶离体培养并产生愈伤组织的培养基；（3）选择适于转化紫花苜蓿的农杆菌品种；（4）选择农杆菌二元质粒，使重组基因处于高效启动子的控制下；（5）将大麦钠氢离子对流泵完整的表达基因克隆，并将其植入农杆菌二元质粒；（6）将重组二元质粒导入农杆菌，并用其感染紫花苜蓿离体叶组织；（7）选择并培养转基因紫花苜蓿整体植株；

上述农杆菌二元质粒的构建步骤是：首先，用PCR将大麦钠氢离子对流泵基因的完整编码序列从它的cDNA克隆中扩增，HvNHX1 PCR引子为5’- CGTCTAGAATGGCGTTCGAAGTGGTGGC -3’ 和 5’- ACGCGAGCTCAGCTGTAATGGCTTTTCTCT -3’；其次，选择农杆菌pBI121作为重组二元质粒的基本架构；将pBI121质粒中的GUS基因用限制性内切酶去除，然后用连接酶植入PCR扩增的大麦钠氢离子对流泵基因HvNHX1；

上述适于紫花苜蓿叶离体培养并产生愈伤组织的培养基包括紫花苜蓿的叶片组织转化为愈伤组织的培养基B5hKTc，该培养基含有以下成分：3.1 g/L Gamborg's B5 salts， 1.0 ml/L 1000x Gamborg's B5 vitamins，0.5 g/L KNO3，0.25 g/L MgSO4(7H2O)，0.5 g/L proline，30 g/L sucrose，pH to 5.7 with KOH，8 g/L Phytagar，植物hormones 1 mg/L 2,4-D，0.1 mg/L kinetin，氨基酸母液30ml/L ( 氨基酸母液含有：26.6 g/L L-glutamine，3.32 g/L serine，0.016 g/L adenine，0.332 g/L L-glutathione)，25 mg/L kanamycin and 500 mg/L ticarcillin；

上述适于紫花苜蓿叶离体培养并产生愈伤组织的培养基包括用紫花苜蓿愈伤组织产生胚胎的B5hOKTc培养基，该培养基含有以下成分：3.1 g/L Gamborg's B5 salts， 1.0 ml/L 1000x Gamborg's B5 vitamins，0.5 g/L KNO3，0.25 g/L MgSO4(7H2O)，0.5 g/L proline，30 g/L sucrose，pH to 5.7 with KOH，8 g/L Phytagar，氨基酸母液30ml/L (氨基酸母液含有：26.6 g/L L-glutamine，3.32 g/L serine，0.016 g/L adenine，0.332 g/L L-glutathione )，25 mg/L kanamycin and 500 mg/L ticarcillin；