[发明专利]一种二步衍生法同步分析碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法

权利要求书

1.一种二步衍生法同步分析碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法，其特征是，具体步骤包括：

1)取样：收集生物基样本；

2)定量待测样品：对生物基样本进行物理洗脱并收集洗脱液；测定洗脱液中肌酐含量，确定肌酐浓度，取相当于2.50μmoL/μL肌酐浓度的洗脱液25μL-300μL作为待测样品，备用；

3)肟化处理过程，即直接在上述待测样品中加入2.5μl-90μl肟化试剂，调PH值至7-14，密封样品并加热至45℃-70℃条件下，充分反应15min-90min，使待测样品完成肟化反应，得肟化反应后的样品；所述肟化试剂的浓度为0.01μg/μl-50μg/μl，肟化试剂选自盐酸羟胺水溶液、甲氧基胺盐-吡啶溶液或乙氧基胺盐-吡啶溶液；

4)预处理：对肟化后的待测样品进行除磷及除硫、除脲素、除蛋白、超声和离心处理后取离心液b，然后干燥，得残留物，即为预处理后的样品；所述干燥是指氮气吹干或真空浓缩干燥或先真空浓缩干燥再氮气吹干；所述除磷及除硫是指在待测样品中加入0.08mol/L-1.2mol/L的钡剂水溶液10μL-200μL，震荡5-30分钟后离心，收集离心液a；所述除脲素是指在上述离心液a中加入含脲素酶3^u/μL-6^u/μL的水溶液30μL-260μL，于25℃-42℃温度下水浴10-45分钟；所述除蛋白是指再加入相对于离心液a 1.5-6.7倍体积的溶剂300μL-2000μL震荡5-30分钟，其中所述溶剂为甲醇、乙醇、丙酮酸、乙晴或吡啶；

5)一次三甲基硅烷化衍生反应：在预处理后的样品中加入25μL-300μL的三甲基硅烷化衍生剂，置干燥加热器上在3℃-200℃温度下衍生10min-120min，得硅烷化衍生反应后的检测样品；

6)采用气质联用分析方法对检测样品中的碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物进行同步检测。

2.根据权利要求1所述一种二步衍生法同步分析碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法，其特征是，步骤(1)中所述的生物基样本包括尿液、血液、脑脊液或组织液。

3.根据权利要求1所述一种二步衍生法同步分析碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法，其特征是，步骤(2)中所述物理洗脱收集洗脱液是指用0.5mL-2.0mL去离子双蒸水、1‰盐酸-甲醇溶液分次洗脱，超声、离心、收集洗脱液。

4.根据权利要求1所述一种二步衍生法同步分析碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法，其特征是，步骤(4)预处理过程中所述氮气吹干是利用氮吹仪在流量为0.001-1.5mL/秒的99.99％氮气下进行；所述真空浓缩干燥是在零下70℃至50℃的温度，并在10Pa以内真空度的条件下进行。

5.根据权利要求1所述一种二步衍生法同步分析碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法，其特征是，步骤(4)所述钡剂水溶液包括Ba(Cl)₂或Ba(OH)₂或Ba(NO₃)₂水溶液。

6.根据权利要求1所述一种二步衍生法同步分析碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法，其特征是，步骤(5)所述三甲基硅烷化衍生剂选自N，O-双(三甲基硅烷基)-2，2，2-三氟乙酰胺、N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺、三甲基氯硅烷、N，O-双(三甲基硅烷基)-2，2，2-三氟乙酰胺与三甲基氯硅烷按照体积比99∶1组成的混合试剂或者N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺与三甲基氯硅烷按照体积比99∶1组成的混合试剂。

7.根据权利要求1所述一种二步衍生法同步分析碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法，其特征是，步骤(6)所述采用气质联用分析方法对检测样品进行检测的条件为：以正十七烷酸或二十四烷酸或托品酸作为内标物质，采用分流式进样，其中氦气与检测样品的体积比为10-50∶1；进样口温度设定为190℃-250℃，以氦气为载气，流速为0.5-3.0mL/min，界面温度为260℃-300℃；质谱检测采用电子离解模式总离子扫描方式，质荷比范围m/z：30-750，扫描周期0.1S-0.5S，色谱柱采用程序升温，从40℃-70℃开始，以3℃/min-7℃/min的升温速率升温至200℃后停留2min-10min，然后以4℃/mi-12℃/min的升温速率升温至280℃后停留2min-10min，再以4℃/min-12℃/min的升温速率升温至320℃，样本分析时间为8min-60min。