[发明专利]一种人血及骨髓树突状细胞分离、纯化及培养的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是指一种人血及骨髓树突状细胞分离、纯化及培养的方法。

背景技术

树突状细胞(dendritlc cell；DC)是存在于外周血、皮肤、淋巴器官及胸腺中的抗原递呈细胞(APC)之一，富集于淋巴组织及非淋巴组织中。树突状细胞具有强大的抗原递呈能力，可将抗原肽表达到树突状细胞的I类和II类上，并分别激活CD4、CD8T细胞，由此诱导活体内对特定抗原(病原微生物抗原、肿瘤抗原、移植抗原等)的免疫应答。DC的强大免疫诱导功能非常适用于多种肿瘤的免疫疗法(DC治疗)。以往的报告表明，在小鼠试验中，用仙台病毒(SeV)刺激的DC具有较强的抗肿瘤效果(S.Shibata et al.，J.Immunol，2006177：3564-3576；Yoneyama，Y.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，2007，355：129-：135)。而抗肿瘤疗效颇受DC按种量的影响。临床试验也认为接种的DC量很大程度影响到治疗效果，但出于患者状态的原囱，可提取的DC前提细胞(Dcprogenitors)数量大多极为有限，不能获取足够数量的DC，因而无法达到理想的治疗效果。所以，如何高效率地扩增有限的DC前体细胞，是解决问题的关键。

发明内容

本发明提出一种人血及骨髓树突状细胞分离、纯化及培养的方法，解决了现有技术中无法高效率地扩增有限的树突状细胞的问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种人血及骨髓树突状细胞分离、纯化及培养的方法，包括如下步骤：

使用羟乙基淀粉和泛影葡胺配制人血及骨髓树突状细胞分离液；

使用碳酸钠、碳酸氢钠和CD123抗体制备人血及骨髓树突状细胞培养瓶；

使用L-脯氨酸、胰岛素、维生素C、L-谷氨酰胺、人脐带血浆、重组人纤维母细胞生长因子和DMEM/F12基础培养基配制人血及骨髓树突状细胞培养液；

分离、纯化和培养人血及骨髓树突状细胞。

进一步地，使用羟乙基淀粉和泛影葡胺配制人血及骨髓树突状细胞分离液的具体步骤为：

称取羟乙基淀粉加热溶解于蒸馏水中，以双蒸水定容，制成质量分数为40％的羟乙基淀粉550料液，备用；

称取泛影葡胺溶于双蒸水中，用氢氧化钠溶液调整pH至pH＝7.5～pH＝8.0，制成质量分数为60％的泛影葡胺料液，备用；

取质量分数为60％的泛影葡胺料液，加入蒸馏水制成质量分数为34％的泛影葡胺溶液，取质量分数为40％的羟乙基淀粉550料液加入蒸馏水制成质量分数为9％的羟乙基淀粉550溶液，将质量分数为34％的泛影葡胺溶液和质量分数为9％的羟乙基淀粉550溶液混和均匀并将其降温至20℃；

用质量分数为60％的泛影葡胺料液调整质量分数为34％的泛影葡胺溶液和质量分数为9％的羟乙基淀粉550溶液的混合液，使其在20℃下比重为1.065-1.077g/ml，即为人血及骨髓树突状细胞分离液粗制品；

用G3漏斗、含100nm亲水性滤芯的亲水性微孔滤器装置以及隔膜真空泵以≤0.06MPa的负压过滤人血及骨髓树突状细胞分离液粗制品，将滤液于百级工作台内灌装于棕色玻璃瓶中，120℃高压灭菌20分钟，即为人血及骨髓树突状细胞分离液成品；

常温避光保存。

优选地，羟乙基淀粉的平均分子量为550万。

优选地，氢氧化钠溶液的质量分数为10％。

进一步地，使用碳酸钠、碳酸氢钠和CD123抗体制备人血及骨髓树突状细胞培养瓶的具体步骤为：

称取碳酸钠、碳酸氢钠于烧杯中并加双蒸水溶解，制成0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，备用；

称取CD123抗体，加制成的0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，制成浓度为10μg/ml的CD123抗体包被液；

向人血及骨髓树突状细胞培养瓶中加入浓度为10μg/ml的CD123抗体包被液，于37℃温箱中包被处理4小时，制成人血及骨髓树突状细胞培养瓶。

优选地，人血及骨髓树突状细胞培养瓶为聚苯乙烯培养瓶。