[发明专利]一种检测活细胞内ATG4B活性的多肽及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种能够特异性检测活细胞中ATG4B酶活性的新型多肽的制备及应用，特别涉及一种新型小肽的设计、合成以及该小肽在检测与ATG4B活性相关的细胞自噬水平方面的应用。

背景技术

自噬相关蛋白4B(Autophagy-raleted protein 4B，ATG4B)是细胞自噬过程中的一种关键酶，首先由等于2003年发现并报道，随后Taichi等解析了其结构，并逐渐阐明了其在细胞自噬发生过程中的作用与机制。

1.ATG4B的基本组成及结构

ATG4B全长由394个氨基酸残基构成，其结构中包含8个α螺旋结构和13个β折叠结构(图1)，共组成柔性与蛋白酶2个结构域。其中D278，H280和C74位氨基酸残基是其发挥功能中的关键位点(图2)。

2.ATG4B在细胞自噬过程中的作用及机制

细胞自噬(Autophagy)是细胞的一种基本存活机制，其主要功能是及时清除细胞内损伤的细胞器、蛋白质等组份，保持细胞内部的清洁与稳定，并能将分解产生的氨基酸等产物作为细胞生长的原料，因此被称为细胞内的“垃圾处理厂”。细胞自噬的过程可分为3个阶段：首先生成一段双层磷脂膜；其次双层膜不断延伸，将需要降解的细胞成分包裹形成自噬小体；然后自噬小体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，并借助溶酶体中的蛋白酶将自噬小体中的细胞成分降解(图3)。

其中，在自噬小体的生成过程中，ATG4B扮演着重要角色。如图4所示，在自噬小体形成过程中，ATG4B首先将其底物蛋白LC3切去一段，使其由LC3-I(18Kda)变为LC3-II(16Kda)，然后由Atg3/Atg7及Atg5/Atg12在LC3-II的C端连接上一段脂链，并将LC3-II锚定在自噬小体的膜上。LC3蛋白在这一过程中的变化是细胞自噬过程的标志性事件，因此被用于鉴定细胞内自噬水平的高低，即LC3-II的量越高代表自噬水平越高，也意味着ATG4B活性越高。

3.ATG4B对LC3的酶解作用

LC3又称为自噬相关蛋白8(Autophagy related protein 8，ATG8)，是细胞自噬发生过程中的关键蛋白，是ATG4B的特异性酶解底物。研究表明，ATG4B在LC3中的酶解位点位于其116位的甘氨酸残基，其中的TFG三肽是ATG4B酶解识别的基本底物序列(图5)，因此TFG三肽可单独作为ATG4B的底物使用。

4.ATG4B活性检测方法

由于ATG4B在细胞自噬发生过程中的重要作用，目前通常将细胞内ATG4B的活性水平作为细胞自噬水平的指标，常用的检测方法包括以下几种：

(1)蛋白质免疫印迹法(Western blot)

通过分离细胞并制备蛋白质样品，电泳分离后使用LC3的抗体检测细胞内LC3-I与LC3-II之间的变化来判断细胞自噬的发生与ATG4B活性。是目前细胞自噬检测中最常用方法，优点是直观、清晰，缺点是无法精确定量，操作繁杂。

(2)基于TFG三肽的活性检测

由于TFG三肽可作为ATG4B的底物直接作用，因此将TFG三肽的C末端用荧光素标记(如AFC)后可用于检测ATG4B活性。但由于TFG三肽不能自由穿过细胞膜而进入细胞，因此需将细胞裂解后，把细胞裂解物与检测底物孵育，然后再检测相关荧光值的变化，从而反映ATG4B活性水平。此方法优点是可以直接定量细胞内ATG4B活性，方法相对简单；缺点是无法直接测定活细胞内的ATG4B活性。

(3)基于LC3蛋白的FRET检测

Min等报道，将LC3蛋白的N端与C端分别偶联绿色荧光蛋白与黄色荧光蛋白，表达的重组蛋白可作为检测底物而测定ATG4B活性。由于检测底物上标记有两种荧光蛋白，其发射波长会发生能量转移(FRET)，而ATG4B切除底物后将C端释放而引起荧光变化可作为检测指标。此方法优点是可直接定量细胞内ATG4B活性，并可高通量检测；缺点是需要制备稳定表达GFP-LC3-YFP重组蛋白的细胞系，质量无法控制，操作繁杂。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种检测活细胞内ATG4B活性的多肽，所述多肽用于检测活细胞内ATG4B活性，具有操作简单，快速，检测结果客观、准确的优点。

本发明所述多肽为融合肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明以ATG4B作用的底物序列TFG为基础，在ATG4B作用的底物序列TFG的N端偶联穿膜肽RKKRRQRRR与氨基酸残基G，得到上述的融合肽。