[发明专利]一种检测肾上腺激素含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种有效的新型分散液液微萃取高效液相色谱法检测生物样品中肾上腺素含量的方法，属于分析化学中痕量生物大分子的分离富集和分析测定技术领域。

背景技术

肾上腺素分为糖皮质激素和盐皮质激素，糖皮质激素常见的有氢化可的松，地塞米松，倍他米松，曲安奈德，倍氯米松，苯丙酸诺龙等。现在中国，日本，欧盟都对糖皮质激素规定了最大残留量，而且我国还将部分糖皮质激素规定为违禁药物。近年来由于新的萃取净化处理技术，更加灵敏的检测技术获得了更多的样品处理简单，回收率更高的分离萃取技术，以及检测限更低，准确性和灵敏度更高的检测方法。

分散液液微萃取(DLLME)于2006年首次提出，是一种基于合适萃取剂的简单快捷的样品前处理技术。只有极微量的有机溶剂和分散剂在萃取剂和水相中，萃取剂和分散剂快速进入到待被分析物的水相中，形成乳浊液。在乳浊液中被诱导形成微小的一滴，通过离心，微小的一滴被富集到试管底部。然后与分析仪器联用。该技术易操作，成本低，环境友好，需用样品少，已经成为非常有潜力的样品前处理技术之一。

现有的检测肾上腺素的方法主要有高效液相色谱法、生物检测法，其中样品前处理是制约检测灵敏度、选择性提高的瓶颈，目前肾上腺素检测使用的样品前处理技术主要有液液萃取、固相萃取、固相微萃取等。本发明采用的分散液液微萃取在已有技术的基础上，一是采取表面活性剂做分散剂，提高分散效果及萃取率，缩短萃取时间；二是将肾上腺素与水扬醛发生衍生反应，改变肾上腺素性质，提高萃取效果，同时由于衍生物共扼体系增大，增强检测信号强度，提高检测灵敏度。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测生物样品中肾上腺激素含量的新方法，该方法对基体复杂的生物样品先采用水杨醛与肾上腺激素发生衍生反应，再用分散液液微萃取对衍生产物进行富集，结合高效液相色谱同时测定多种痕量肾上腺素，具有操作简单，富集倍数高，结果准确等特点。

本发明分散液液微萃取高效液相色谱法检测生物样品中肾上腺素含量的方法，包括以下步骤：

（1）工作曲线的制作：配制一系列不同浓度的肾上腺素混合标准溶液，在一定色谱条件下，注入高效液相色谱进行分析，制作工作曲线，得到肾上腺素的检测限和线性回归方程；一般采用的配制浓度为1.00、10.00、50.00、100.00、150.00、200.00、250.00、300.00 ng/mL。

（2）样品处理：在待测生物样品中加入1～2ml乙腈、0.1～0.5g氯化钠、0.1～0.5g氯化锌、0.1～0.5g醋酸钠、0.1～0.5g硫酸镁试剂中一种，混匀，在转速5000～12000r/min下离心10～20min，取出上清液，用pH 5.5～8.0的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液稀释至5ml，备用；

（3）分散液液微萃取：将100-300μL萃取剂，0.5-1.0mL 5%(w/v)衍生试剂水杨醛和0.5 -1.0mL 0.05%～0.1% (v/v)分散剂混匀，立即加入备用样品5mL上清稀释液中，超声，形成乳浊体系；然后在3000～8000 r/min下离心2～10 min，离心后离心管底形成一滴有机相；

（4）样品测定：吸取步骤（3）中离心管底部的有机相过滤，在与步骤（1）相同色谱条件进行HPLC分析，并对照步骤（1）所得的线性回归方程，计算出样品中的肾上腺素含量。

本发明中肾上腺素为地塞米松、曲安奈德、丙酸倍率米松、丁酸氢化可的松、苯丙酸诺龙、泼尼松、醋酸可的松、甲基泼尼松龙中一种或几种。

色谱流动相为：色谱条件为以乙腈-0.1%甲酸溶液作为流动相，梯度洗脱为质量百分比浓度80％乙腈洗脱第0～3 min，质量百分比浓度80％～90％乙腈洗脱第3～6.5 min，质量百分比浓度90％乙腈洗脱第6.5～8 min。

本发明中生物样品为全血或尿液，检测前在-20℃下保存备用，血液处理量为0.5～1.0ml，尿液的处理量为5.0ml。

本发明中萃取剂为二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳中一种。

本发明中分散剂为甲醇、乙腈、丙酮、非离子表面活性剂聚乙二醇辛基苯基醚Triton X系列、非离子表面活性剂醇聚氧乙烯醚中一种。 

本发明中非离子表面活性剂聚乙二醇辛基苯基醚Triton X系列试剂为Triton X-100或Triton X-114。

本发明中非离子表面活性剂醇聚氧乙烯醚为Tergitol TMN-6。

本发明方法的最低定量限为0.010ng/mL。