[发明专利]红球菌催化水解腈合成氯代苯乙酸及其衍生物的方法

说明书

技术领域

本发明公开了土壤中分离的腈水解酶产生菌用于催化腈水解制备氯代苯乙酸及其衍生物的方法，属于微生物技术领域。

背景技术

氯代苯乙酸类化合物（邻氯苯乙酸、间氯苯乙酸、对氯苯乙酸等）是一种重要的有机合成中间体，广泛地用于香料、农药和医药等合成。随着其市场的不断扩展，氯代苯乙酸的需求不断增加，应用范围也逐渐拓宽。目前，氯代苯乙酸生产主要通过化学水解氯代苯乙腈及羰基合成法合成(中国专利，申请号200610124564.1)。这些方法虽然已取得了较好的效果，但同时也有一些不足之处，例如，产物中都含有杂质，并且化学合成法通常存在产品收率低、成本高和环境污染严重等缺点，与之相比，由于利用生物法实现氯代苯乙酸的合成具有反应条件温和，产品收率高等优点，符合绿色化学的发展要求，而越来越受到国内外学者的青睐。生物法中涉及腈水解的酶系主要有腈水解酶、腈水合酶和酰胺酶；腈水解酶能将腈水解生成相应的羧酸和氨，具有选择性好、反应条件温和及产品纯度高等优点，明显优于化学法水解(Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 2010, 377: 741-750；Applied Microbiology and Biotechnology. 2011, 89: 817-823)。然而，少有报道腈水解酶生物催化氯代苯乙腈高效合成氯代苯乙酸的工艺，利用腈水解酶法实现氯代苯乙酸的高效合成成为当务之急。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是公开一种红球菌用于催化腈水解制备氯代苯乙酸的方法，以实现氯代苯乙酸的高效合成。

本发明所述的红球菌催化水解腈合成氯代苯乙酸及其衍生物的方法，按照下述步骤进行：

（1）将红球菌在培养基中进行扩增培养，离心得到静息细胞；

（2）收获静息细胞，悬浮于pH为6.0~8.0的磷酸钾缓冲溶液中，加入氯代苯乙腈及其衍生物，在25~35 °C条件下反应2~120 h后，收集氯代苯乙酸及其衍生物产品。

其中步骤（1）中所述的氯代苯乙腈及其衍生物的浓度为50~2000 mM。

其中步骤（1）中所述的静息细胞在磷酸钾缓冲溶液中的含量为0.01-0.1 g静息细胞/mL。

其中步骤（1）中所述的发酵培养基组分和含量如下：葡萄糖5~20 g，蛋白胨5~20 g，酵母膏5~20 g，KH₂PO₄ 1~5 g，NaCl 0.1~1.5 g，MgSO₄ 0.1~0.5 g，诱导剂苯乙腈 0.01~10 g，水 1000 mL，pH 6.0~9.0；

其中步骤（2）中所述的氯代苯乙腈及其衍生物为邻氯苯乙腈、间氯苯乙腈、对氯苯乙腈、α-羟基苯乙腈或α-羟基邻氯苯乙腈。

其中步骤（1）中所述的红球菌Rhodococcus sp. CCZU10-1，该菌株已于2011年5月25日保藏在位于中国北京的北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 4911。

本发明的优点：本发明利用Rhodococcus sp. CCZU10-1生物催化剂实现氯代苯乙腈的水解合成氯代苯乙酸等产品，具有工艺路线简单、反应条件温和、无污染、无副产物及转化率高等优点。

附图说明

图1是利用Rhodococcus sp. CCZU10-1静息细胞催化对氯苯乙腈生产对氯苯乙酸反应进程曲线。

具体实施方式

本发明所涉及的Rhodococcus sp. CCZU10-1。该菌株已于2011年5月25日保藏在位于中国北京的北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 4911，已申请专利，公开号CN102250802A。菌株理化特征如专利(中国专利，公开号CN102250802A)所描述。

本发明中氯代苯乙酸的含量用HPLC进行分析。腈水解酶催化剂的活力单位定义：每分钟水解氯代苯乙腈产生1 μmol氯代苯乙酸所需要的生物催化剂量。

 

实施例1 

Rhodococcus sp. CCZU10-1生长细胞催化间氯苯乙腈水解生产间氯苯乙酸