[发明专利]一种普鲁兰多糖的纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用Savage法、分级醇沉和凝胶层析纯化普鲁兰多糖的方法，属于生物技术领域。

技术背景

普鲁兰多糖是短梗霉多糖(pullulan)的中文译名，是通过黑酵母菌的一种出芽短梗霉发酵所产生的胞外多糖，是无味无嗅的白色粉末。其化学组成主要是由α-1.4葡萄糖苷键连接的聚麦芽三糖，分子结构中含1/3的α-1.6葡萄糖苷键，2/3的α-1.4葡萄糖苷键，受不同发酵培养条件的影响，分子量一般在5.0×10⁴-5.0×10⁶道尔顿之间。该多糖易溶于水，安全无毒、可食用、低热值、耐酸碱、可塑性好、成膜性好、簿膜隔气性佳。因其在自然界可被微生物降解利用，不会引起环境污染，故被誉为无公害塑料。

1938年R.Bauer从微生物的培养物中发现普鲁兰多糖的产生菌，而普鲁兰多糖的研究工作则起始于西德，英国人在理论方面也作了不少工作，日本进行了比较系统尤其是生产工艺和产品应用的研究，并取得了大量专利。1976年至1980年是普鲁兰多糖的第一个研究高峰，主要是对其性质和发酵方法的研究，1984年至1996年是第二个研究高峰，主要集中在对其产生机理和应用方面的研究。我国在80年代初期开始进行相关研究，虽然在菌种和工艺方面取得了一定成绩，但生产厂商较少。普鲁兰多糖的纯化工艺一般采用氯仿/丁醇混合溶液除去蛋白质后透析，后用溶液洗涤、干燥，经DEAE-纤维素柱层析，收集多糖峰，减压浓缩、透析、冷冻干燥。反应时间较长，多次用到透析，对溶剂消耗量较大，且所得到的普鲁兰多糖纯度多在90％-95％之间。

发明内容

本发明的目的在于提供一种不同于传统的普鲁兰多糖的纯化方法，采用发明所述的工艺方法，制得普鲁兰多糖的含糖量在99％以上，产品得率高。

本发明提供的普鲁兰多糖的纯化工艺是以普鲁兰多糖粗品为原料(含糖量20％左右——硫酸苯酚法测定(中国药学杂质，1996，31(9)：550)，分子量为5000-15000道尔顿)，对其进行纯化，使之达到多糖纯度在99％以上，其具体包括以下步骤：

(a)将粗品普鲁兰多糖加蒸馏水稀释成普鲁兰多糖水溶液，加入氯仿/正丁醇或氯仿/戊醇混合液，充分震荡，离心，除去沉淀，将上清液再用此方法重复处理，最后得到脱去蛋白的上清液，减压蒸馏除去有机溶液，冻干，得到粗普鲁兰多糖。

(b)将一定量的粗普鲁兰多糖溶解在蒸馏水中，加入乙醇，醇析，离心，沉淀为普鲁兰多糖，然后继续向上清液中加入乙醇，至不同梯度的乙醇浓度，每次操作如上所述。

(c)将分级醇沉淀得到的粗普鲁兰多糖用Sepharose 6fast flow(2.6×60cm)凝胶层析住分离，分部收集器分管收集减压旋蒸含有活性物质的洗脱液，得到普鲁兰多糖，再用冷冻乙酸乙酯冲洗，冻干，既得普鲁兰多糖纯品。

本发明所提供的方法，相对于现有普鲁兰多糖纯化方法，具有以下优势：

(1)传统方法在除去普鲁兰多糖粗品的小分子时采用的是透析方法，所用时间较长，一般一次透析在8小时以上，且整个纯化工艺中至少要使用3次透析；本发明所采用方法采用分级醇沉方法除去小分子，只需一次分级醇沉，所用时间在2-8小时，大大节省了纯化时间；

(2)传统方法制得的普鲁兰多糖的多糖纯度在90％-95％，而采用本发明所提供方法，普鲁兰多糖的多糖纯度能达到99％以上，收率(以多糖含量计算，下同)在58％以上。

具体实施案例

下面通过实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，所用术语从事生物技术行业的技术人员均能读懂。

实施例1

(a)将粗品普鲁兰多糖100g加蒸馏水稀释成1.5％的普鲁兰多糖水溶液，加入氯仿/正丁醇(V_氯仿∶V_正丁醇＝4∶1)混合液，充分震荡，以2000r/min离心15min，除去沉淀，将上清液再用此方法重复处理8次，最后得到脱去蛋白的上清液，减压蒸馏除去有机溶液，冻干，得到粗普鲁兰多糖。

(b)将粗普鲁兰多糖溶解在蒸馏水中，加入95％乙醇至浓度为20％(体积浓度，下同)，4℃醇析8小时，以15000r/min离心10min，沉淀为普鲁兰多糖，然后继续向上清液中继续加入乙醇，至终浓度分别为30％、40％、50％、60％、70％，每次操作同前所述。