[发明专利]检测硝基咪唑类药物的酶联免疫试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测硝基咪唑类药物的酶联免疫试剂盒，其适用于蜂蜜中硝基咪唑类药物测定。

技术背景

硝基咪唑类药物是畜禽饲料中常用的抗原虫感染及抗菌药，主要用于防治家禽组织滴虫和寄生虫、牛的滴虫，猪的出血性肠炎、鱼的寄生虫感染、蜂的微孢子虫病等，并具有促生长作用，但是该类药物及其某些代谢物对哺乳动物具有致癌、致畸、致突变作用和遗传毒性，因此硝基咪唑类药物的不合理使用造成可食性动物组织中药物残留问题危害到人类的食品安全，我国已经禁止甲硝唑、地美硝唑、洛硝唑在肉食食品中使用，替硝唑禁止在兽药中使用，因此，需要一种既灵敏又精确的方法同时测定蜂蜜中的硝基咪唑类药物。

目前检测硝基咪唑类药物的方法主要有：高效液相色谱-紫外色谱、高效液相色谱二极管陈列检测器法，气相色谱氮磷检测器法、高效液相色谱-电喷雾质谱法，气相色谱法等，仪器检测方法操作繁琐且费用较高，推广应用受到限制。

发明内容

本发明的目的在于针对上述不足提供一种用于硝基咪唑类药物含量测定的酶联免疫试剂盒，其操作简单适合现场大批量样品的筛选。

本发明试剂盒，它包括：

(1)包被有甲硝唑偶联抗原的酶标板；

(2)酶标记抗抗体；

(3)硝基咪唑类药物特异性抗体；

(4)甲硝唑标准品溶液；

(5)底物显色液；

(6)终止液；

(7)浓缩洗涤液；

(8)复溶液。

所述甲硝唑偶联抗原为甲硝唑半抗原与载体蛋白的偶联物，所述载体蛋白可为卵清蛋白、牛血清白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白。

所述甲硝唑半抗原的结构如下：

所述甲硝唑半抗原制备过程：0.85g甲硝唑和1.0g琥珀酸酐，加入10ml吡啶，室温下搅拌12-20小时，蒸干溶剂，乙酸乙酯溶解，饱和氯化铵溶液洗涤，水洗，干燥，除去溶剂后在环己烷-乙酸乙酯中重结晶得到白色固体，为甲硝唑半抗原。

所述酶标记抗抗体的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶标记抗抗体是采用戊二醛法或过碘酸钠法将标记酶与羊抗鼠抗抗体进行偶联得到的，优选过碘酸钠法。所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体。

所述硝基咪唑类药物特异性抗体可为硝基咪唑类药物单克隆抗体或硝基咪唑类药物多克隆抗体；它们均是用甲硝唑偶联抗原为免疫原得到的；所述硝基咪唑类药物特异性抗体可为鼠源、马源、羊源或兔源抗体，所述硝基咪唑类药物单克隆抗体优选为硝基咪唑类药物鼠单克隆抗体，所述硝基咪唑类药物多克隆抗体优选为硝基咪唑类药物兔多克隆抗体。

为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括甲硝唑标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、复溶液。

所述浓缩洗涤液为pH7.2-7.6，含有0.5-1.0％吐温20，0.01-0.04‰叠氮化钠的0.1-0.2mol/L磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量百分比。

所述复溶液为pH6.5-6.8含有5-10％酪蛋白的0.1-0.2mol/L磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量百分比。

当标记酶为辣根过氧化物酶时，显色剂由显色液A液和显色液B液组成，所述显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为1～2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为碱性磷酸酯酶时，显色液为对硝基磷酸盐缓冲液、终止液为1～2mol/L氢氧化钠溶液。

其中酶标板在制备过程中所用的包被缓冲液为pH9.0-9.6，0.1-0.2mol/L碳酸盐缓冲液，所用封闭液为pH7.2-7.6，含有0.5-0.8％脱脂奶粉，0.1mol/L磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量百分比。

本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被抗原稀释成0.1～0.2μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h或4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150～200μl封闭液，37℃温育1～2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

本发明的检测原理为：