[发明专利]一种适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法。

背景技术

自20世纪90年代荧光蛋白(GFP)及其衍生物(XFPs)被发现并作为一种新型标记物应用到动物学，植物学、生物学及药学等领域后，生命科学得到了突飞猛进的发展。利用现代分子遗传技术，可将XFPs与任意感兴趣的蛋白质连接起来，然后通过观察其荧光，从而能观察到被标记蛋白的空间位置，运动及相互作用。不仅如此，借助XFPs标记技术，还能特异性标记各种细胞，如神经元在脑内的三维空间分布及连接关系，对研究生物体的结构和功能关系具有重要作用。

在早期的研究中，一般采用普通荧光显微镜对XFPs标记的生物样品成像，但由于受成像景深的限制只能获得薄切片样本的二维图像。后来，共聚焦和双光子显微镜技术的应用显著增加了对荧光样品的成像深度，但由于受组织散射等光学参数的限制，其最大成像深度仍小于1毫米，仍无法用于获取厘米尺寸大生物样品的三维数据。近十年来，为了能对大尺寸生物样品进行高精度三维成像，国内外发展了一系列通过机械薄切片提高样本轴向分辨率及成像范围的新型光学成像技术，如显微光学断层成像系统(MOST)，刀锋扫描成像系统(KESM)等。这些技术为了保证生物样品能进行超薄切片，基本上都是采用电镜的包埋方法，即采用树脂包埋生物样品。

电镜中使用的树脂一般可以分为两类，一类是环氧类树脂，如Spurr和812等，具有疏水特性，使用前需要样品完全脱水；另一类是丙烯酸类树脂，如LR White，LR Gold及Lowicryl等，具有亲水特性，使用前容许样品含有一定量的水分。有文献报道，一些极端的理化条件，如高温，强氧化还原剂，强酸强碱及完全脱水等，均会导致XFPs的荧光强度降低甚至淬灭，所以需要样品完全脱水的环氧类树脂不适合用于制备XFPs标记的生物样品。近几年有研究者开始尝试在超低温条件下用亲水性的丙烯酸树脂来包埋XFPs标记的生物样品，如GFP或RFP标记的细胞，斑马鱼胚胎，线虫等等，所得样品可进行超薄切片并能用于获取荧光图像，如文献“Fluorescence-integrated transmission electron microscopy images：integrating fluorescence microscopy with transmission electron microscopy.(Sims，P.A.and J.D.hardin，Methods Mol Biol 369(2007)291-308)”、“A Single Method for Cryofixation and Correlative Light，Electron Microscopy and Tomography of Zebrafish Embryos.(Nixon，S.J.，R.I.Webb，et al.Traffic 10(2009)131-136)”、“Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision.(Kukulski，W.，M.Schorb，et al.The Journal of Cell Biology 192(2011)111-119)、“Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy.(Watanabe，S.et al.Nature Methods 8(2011)80-84)”等。然而，上述这些文献中提供的荧光样品制备方法仍存在如下局限：(1)使用了快速高压冷冻仪和冷冻替代仪等昂贵设备，无法在普通实验室推广；(2)快速高压冷冻仪仅用于处理小于200微米厚度的组织，所以基于此设备的样本制备方法也只能用于处理尺寸小于200微米的生物样品；(3)使用了醋酸铀或四氧化饿等重金属类固定液，不仅具有很大毒性，而且还会降低XFPs的荧光；(4)所得生物样品仍存在一定量的荧光损失，有的甚至高达40％以上；(5)所有操作均需要在-90℃至-20℃的超低温环境下进行，且操作繁琐，只有经过专业训练的人员才能掌握。