[发明专利]一种谷糠抗肿瘤活性蛋白及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物蛋白的制备和应用，具体属于一种谷糠抗肿瘤活性蛋白及其制备方法，以及该蛋白在制备抗肿瘤药物和保健食品中的应用。

背景技术

谷子，即粟(Setaria italica)，一年生禾本科属植物，起源于我国黄河流域，我国的年产量占全世界的五分之四，华北为主要产区，其中山西是谷子的主要产地。谷糠是谷子加工成精米过程中得到的副产品，在工艺学上叫做谷糠。

《黄帝内经》认为“谷气通于脾，”谷糠味甘，性平，偏于补气，具有益气健脾，养血安神，补肾健脑之功效。谷糠与谷物同性，功同米而优于米，补而不滞，温而不燥，谷糠中含有丰富的甘油三酯、脂蛋白、谷维醇、维生素B、维生素E、葡萄糖、纤维素以及微量元素等，能够排出人体内的毒素，有健脑、补肾、强身、抗癌等作用，经常食用谷糠，可以增强人体的免疫功能，防病健身。所以谷糠这一资源的深度开发和有效利用将会带来很高的经济和社会价值。

经对现有技术的文献检索发现，目前国内外关于谷糠的研究主要集中在其化学成分和营养价值方面，而未见关于谷糠抗肿瘤活性蛋白的报道。本发明制备的谷糠蛋白具有较强的抗肿瘤活性，而对正常细胞无毒副作用。这一发现对于谷糠的深度开发和有效增值利用具有潜在的经济价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种谷糠抗肿瘤活性蛋白及其制备方法，以及该蛋白在制备抗肿瘤药物和保健食品中的应用。

本发明提供的一种谷糠抗肿瘤活性蛋白，通过包括如下步骤的方法制得：

第一步：取谷糠，粉碎后，加入预冷的蛋白提取液，4℃下浸泡并搅拌12-16小时，离心后取上清液，即为谷糠蛋白粗提液；离心后的滤渣可重复提取1-2次；

所述的蛋白提取液为20mmol/L Tris-HCl溶液，含0.85％NaCl，1mmol/L PMSF，pH8.0；所述的谷糠和蛋白提取液的重量体积比(W/V)为1∶4-6，优选1∶5；

第二步：在谷糠蛋白粗提液中加入2-3倍体积的-20℃预冷的丙酮沉淀蛋白1-2小时，离心，收集沉淀，在-20℃下放置20-30min，使丙酮完全挥发，冷冻干燥，得到谷糠粗蛋白；

第三步：将谷糠粗蛋白用pH8.0、20mmol/L Tris-HCl缓冲液溶解，离心后取上清液，按硫酸铵溶液饱和度计算表(0℃)先加入30％饱和度的硫酸铵粉末，充分搅拌溶解后，静置30min，离心，收集上清液，再向上清液中加入85％饱和度的硫酸铵粉末，充分搅拌溶解后，静置30min，离心，收集沉淀，用pH8.0、20mmol/L Tris-HCl缓冲液溶解、透析、浓缩即得到谷糠抗肿瘤粗蛋白；

第四步：将抗肿瘤粗蛋白用pH8.0、20mmol/L Tris-HCl缓冲液溶解，过Q阴离子交换层析柱，紫外检测仪于280nm波长处检测，收集穿透峰；

第五步：将上述穿透液过SP-阳离子柱交换层析柱，用含0.1mol/LNaCl的pH8.0、20mmol/LTris-HCl缓冲液洗脱，紫外检测仪于280nm波长处检测，收集洗脱峰得到谷糠抗肿瘤活性纯蛋白(FMB)。

第三步、第四步、第五步均在0-4℃条件下进行。

采用SDS-PAGE凝胶电泳技术，通过与标准分子量比对，预估谷糠抗肿瘤活性蛋白的分子量约为36kDa。

经体外抗肠癌肿瘤活性检测显示，该谷糠蛋白可明显抑制大肠癌细胞增殖和转移，用该蛋白处理大肠癌细胞48小时，平均致死率约为40％，而对正常细胞生长无明显毒副作用。该蛋白可以在制备抗肿瘤药物中应用，也可在保健食品中应用。

与现有技术相比，本发明获得的抗肿瘤活性的谷糠蛋白经体外抗肿瘤活性检测，该蛋白具有良好的抗大肠癌细胞的活性，对大肠癌细胞增殖以及迁移有明显抑制作用，而对正常细胞没有明显毒副作用。

附图说明

图1谷糠抗肿瘤活性蛋白SDS-PAGE电泳图(经SP柱纯化后所得纯蛋白样品，上样量为3μg；FMB：目的蛋白；Marker：标准分子量)

图2谷糠抗肿瘤活性蛋白FMB对细胞生长的影响

图3A细胞划痕实验观察谷糠抗肿瘤活性蛋白对细胞迁移的影响

图3B细胞划痕实验观察谷糠抗肿瘤活性蛋白对细胞迁移的影响(×4)

具体实施方式

实施例1谷糠抗肿瘤活性蛋白的制备