[发明专利]一种猪防御素pBD1多肽及其在抑制猪病原菌中应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪防御素pBD1多肽、编码其的基因及其在抑制猪病原菌中应用。

背景技术

我国是养猪和猪肉生产大国，生猪饲养量、猪肉产量均位居世界第一，猪肉安全始终是关系到农村经济发展和社会安定的一个根本问题，具有“无猪不稳，猪粮安天下”的战略意义。目前抗生素滥用问题严重制约了我国养猪业的持续健康发展，甚至已经到了影响国计民生的地步。由于我国养殖业长期依赖抗生素，造成了疫情难解和疫苗失效。因此寻找和开发优质、安全、高效、廉价、无公害的抗生素替代品，已成为目前世界和我国关注的焦点和热点。

防御素是生物界广泛存在的一类抗菌肽类物质，在哺乳动物体内主要由上皮细胞或免疫细胞产生，除了可以杀死多种细菌、分枝杆菌、真菌、病毒等病原微生物，还能够迅速动员免疫系统，激活固有免疫和获得性免疫反应抵抗动物体外各种生物逆境，是机体抵御外界微生物侵袭的第一道化学屏障(Boman，1995；Ganz，2003；Yang et al.，2007)。

防御素的抑菌机理和其蛋白结构特点有关。防御素是富含半胱氨酸的阳离子多肽，可以与带阴离子的细菌细胞膜结合，结合后其分子中的疏水区可插入细胞膜，破坏细胞膜的完整性，使细胞的必需代谢物质外泄，导致病原菌不可逆性死亡。防御素具有抗病毒的作用则是通过与病毒外壳蛋白结合导致病毒失去生物活性(Matsuzaki，2001)。高等动物的细胞由于细胞膜中负电荷含量较低而不会受到防御素的破坏。防御素不直接作用于病原菌的功能蛋白，而是作用于病原菌的细胞膜发挥抑菌作用，因此不会使病原菌对其产生耐药性。而且与抗生素相比，防御素还具有抗病毒、激活机体免疫力的作用。由于具有以上优点，防御素可以成为全新的抗病菌、提升免疫的饲料添加剂，未来将在动物养殖、疾病预防和提高畜产品品质等方面发挥巨大作用。

目前，在脊椎动物、无脊椎动物和植物中发现的防御素已超过500多种。通过基因克隆和基因组同源序列分析，在猪体内已发现12种防御素，均以β-防御素的形式存在。这些防御素在猪体内的表达部位不同，分布于消化道、呼吸道、淋巴器官、肾、脾、睾丸、附睾及骨髓等器官内以及中性粒细胞和肺泡巨噬细胞内，对猪先天免疫，特别是黏膜先天免疫，发挥着重要作用(Sang et al.，2006)。研究发现pBD1不仅可以杀死Escherichia coli，Salmonella typhimurium，Listeria monocytogenes和Candida albicans等猪致病菌(Shi et al.，1999)，而且可以激活新生仔猪的先天免疫功能，饲喂500μg防御素pBD1可以使新生仔猪获得对百日咳鲍特菌的免疫能力，预防百日咳鲍特菌引起的支气管肺炎(Shokrollah et al.，2006)。在肠道中，防御素可以通过增加其表达量直接杀死入侵的致病性细菌，比如猪致病性沙门氏菌Salmonella Typhimurium可以明显使猪空肠上皮细胞系的pBD1和pBD2的表达量增加(Edwin et al.，2009)，Salmonella Enteritidis感染可以使猪肠道细胞系pBD1的表达量增加10倍(Edwin et al.，2006)。猪防御素还具有促进动物生长的作用，在日粮中添加pBD1的肉用仔鸡的生长性能、小肠吸收营养能力以及肠道黏膜免疫能力均有明显增强(Bao et al.，2008)。

由于防御素在动物体内的天然含量很低，提取步骤繁琐，而化学合成法的生产成本昂贵，严重影响了防御素的研究和应用。基因工程法是获得大量、廉价防御素的最佳途径。防御素在大肠杆菌、酵母菌、昆虫、植物中的表达已有相关报道。彭力(2004)在大肠杆菌中表达了人β防御素2，优化了发酵条件和产物分离的方法。任海清(2009)在毕赤酵母GS115中表达了猪防御素pBD1。JISHU SHI等人(1999)利用杆状病毒载体，成功的在草地夜蛾体内表达了猪防御素pBD1。王义琴等(2001)人以小球藻作为宿主，成功表达了兔防御素，为兔防御素的产业化奠定了基础，张秀海等(2000)在番茄中成功地表达了兔防御素NP-1。虽然在以上所述几种生物系统中成功表达了防御素，但是防御素的异源表达量低依然是制约防御素产业化应用的瓶颈。

发明内容

本发明提供一种猪防御素pBD1多肽及其在抑制猪病原菌中应用。

首先，本发明提供一种猪防御素pBD1多肽，其为由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质。