[发明专利]诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液及诱导方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用新型植物诱导剂Conophylline与尼克酰胺联合高效诱导人脂肪干细胞分化为功能性胰岛样细胞团的培养液及诱导方法和用途。

背景技术

一型糖尿病又称为胰岛素依赖型糖尿病，是原发性T细胞介导的自身免疫疾病，最终导致β细胞大量破坏，胰岛素分泌不足，血糖浓度调节失衡，严重危害人类健康。胰岛移植是治疗糖尿病的最有效方式，但供体细胞严重不足，需寻找新的胰岛移植替代物。间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，它能够定向诱导为胰岛样细胞、软骨细胞等多种细胞。且间充质细胞存在于人体多种组织中，尤其是脐带、胎盘、脂肪组织来源的间充质干细胞，具有来源广泛、易于采集、无伦理问题等优势，可规模化诱导分化为胰岛样细胞，为临床治疗糖尿病提供新的技术方案。

尼克酰胺是ADP核糖合成酶抑制剂，能促进人胎儿胰腺的分化，并在长期高糖环境中保持胰岛细胞对葡萄糖刺激的正常反应，因而被广泛用于胰岛素分泌细胞的诱导分化环境构成成分。Conophylline具有诱导胰腺前体细胞模型-AR42J细胞体外分化为胰岛素分泌细胞的能力，并且和Activin-A相比，Conophylline分子量小，易于渗透，不会诱导细胞的凋亡，被认为是一种神奇的植物诱导剂。已有文献报道Conophylline诱导骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的效率比Activin-A更高。

目前将间充质干细胞诱导分化为胰岛样细胞团多采用贴壁诱导的方式。因间充质干细胞有较强的贴壁性，在诱导过程中阻碍了细胞聚集成团，因此诱导率普遍较低。二部法或者三步法，诱导因子使用较多，诱导周期一般为14-21天，诱导周期长、残留因子种类繁多，增加了临床应用的风险。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液及诱导方法和用途。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液，包括尼克酰胺、Conophylline、细胞生长因子、细胞调节素和基础培养基。

每升基础培养基中含有：

所述细胞生长因子为HGF、bFGF或EGF。

所述细胞调节素为Betacellulin。

所述基础培养基含有97％的高糖DMEM、2％的B-27、1％的N-2，所述浓度为体积比浓度。

一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的方法，包括以下步骤：

(1)配制诱导培养液：以高糖DMEM为基础培养基，添加2％的B-27、1％的N-2和诱导剂尼克酰胺、Conophylline、HGF、Betacellulin，混匀，4度保存，所述浓度为体积比浓度；

(2)制备人间充质干细胞；

(3)取人间充质干细胞，以1.5-2×10⁵cells/孔接种于6孔超低吸附培养板中，每孔添加3ml诱导培养基，悬浮诱导；

(4)每3天换液，于9天时收集细胞上清液，-20度保存。

含有诱导剂尼克酰胺和Conophylline的培养液在诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化中的应用。

本发明的有益效果是：利用尼克酰胺与Conophylline联合诱导人间充质干细胞向胰岛样细胞团分化，缩短诱导周期，使悬浮细胞利于成团，形成类似天然胰岛的细胞团，显著提高诱导分化效率；显著减少细胞因子使用种类，降低临床应用风险；显著提高诱导细胞胰岛素分泌功能。克服了现有诱导剂及诱导方法中细胞不易聚集成团、诱导周期长、效率低、所得细胞数量少、功能差、细胞易凋亡等缺点。

附图说明

图1A是hADSCs原代培养过程中形态变化(40×)。

图1B是hADSCs传代培养(P6)(4×)。

图1C是hADSCs生长曲线。

图2hADSCs表面特异性蛋白检测。

图3诱导后的脂肪细胞、成骨细胞鉴定(A，B：40×；C：4×；D：10×)。

图4hADSCs分化与胰岛样细胞团的形成(10×)。

图5Insulin、c-peptide免疫细胞化学分析(40×)。

图6胰岛细胞分化过程中相关基因的表达。

图7葡萄糖刺激下胰岛素的分泌水平(P＜0.001)。

图8诱导9天后不同诱导组胰岛素分泌量(P＜0.05vs(NIC+CNP))。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：